[发明专利]一种从发芽咖啡豆中提取α－半乳糖苷酶的方法

摘要

一种从发芽咖啡豆中提取α－半乳糖苷酶的方法，涉及酶制剂技术领域。本发明以发芽咖啡豆为原料，经粉碎、粗提、硫酸铵沉淀、阴离子柱层析、凝胶柱层析等工序，控制料液比、提取温度、搅拌速度、提取时间、硫酸铵浓度、阴离子柱层析的缓冲液和洗脱液的浓度、凝胶柱层析的缓冲液浓度等条件，制得α－半乳糖苷酶。所得α－半乳糖苷酶的比酶活高于绿咖啡豆来源的商品α－半乳糖苷酶的比酶活，本发明方法制得的α－半乳糖苷酶能够获得更加广泛的应用，特别是在低聚糖转糖苷方面的应用研究。

主权项

1、一种从发芽咖啡豆中提取α-半乳糖苷酶的方法，其特征是选用发芽咖啡豆为原料，经粉碎、粗提、硫酸铵沉淀、阴离子柱层析和凝胶柱层析工序制得α-半乳糖苷酶，工艺条件为：(1)原料：选取饱满的咖啡豆种子，沙床培养发芽50～70d后，选取已经发芽的咖啡豆种子，洗净发芽咖啡豆种子表面沙粒，吸干发芽咖啡豆种子表面水分，作为提取α-半乳糖苷酶的原料；(2)粉碎：将物料放入-40℃冷藏箱中冷冻20～24h，取出，用微粉碎机粉碎，使物料粒度达到孔径0.25mm试验筛筛上物≤30％质量百分数；(3)粗提：将粉碎后的物料放入提取液中，提取液中含氯化钠质量浓度0.5％～1％，发芽咖啡豆粉与提取液的料液质量比1∶4～1∶5，提取温度4℃，搅拌速度100～200r/min，提取时间25～60min；提取结束后，将混合物放入离心管中，冷冻离心，离心温度4℃，离心速度15 000～20 000×g，离心时间2～5min，得上清粗酶液；(4)硫酸铵沉淀：向粗酶液中添加硫酸铵粉末，缓慢搅拌，最终达到质量浓度50％～60％饱和硫酸铵浓度，4℃静置24～36h，冷冻离心，离心温度4℃，离心速度10 000～15 000×g，离心时间2～5min，冷冻离心结束后，取出沉淀物；(5)阴离子柱层析：将得到的沉淀物溶解在25～50mmol/L、pH 6～6.5的Tris-HCl缓冲液中，上DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，洗脱液为0.3～0.5mol/L NaCl溶液；洗脱下来的目的蛋白冷冻干燥，温度-40℃，真空度≤12Pa，干燥时间24～48h，得到酶粉；(6)凝胶柱层析：经阴离子交换柱纯化得到的酶粉溶解于0.3～0.5mol/L、pH 5～6的磷酸缓冲液中，上Sepharose CL-6B凝胶柱层析进行纯化，洗脱液为0.3～0.5mol/L、pH5～6的磷酸缓冲液，洗脱下目的蛋白进行冷冻干燥，温度-40℃，真空度≤12Pa，干燥时间24～48h，得到酶粉，即为α-半乳糖苷酶酶粉。