[发明专利]差动共焦拉曼光谱测试方法

摘要

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种差动共焦拉曼光谱测试方法。该方法融合差动共焦检测方法和拉曼光谱检测方法技术特点，构成一种可实现样品微区光谱检测的测试方法，通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，探测对应位置的拉曼光谱，同时采用设计的光瞳滤波器，锐化差动共焦拉曼光谱系统的爱里斑主瓣，改善其微区拉曼光谱探测能力，精确获取包括微区样品光谱信息和位置信息的微区空间光谱信息。本发明显著提高了共焦拉曼光谱显微镜的微区光谱探测能力；具有绝对跟踪零点和双极性跟踪特性，实现几何尺度绝对测量；可广泛应用于生物医学、生命科学、生物物理、生物化学、材料、工业精密检测等技术领域，进行微区几何位置和光谱特性的高精度检测，具有极其重要的应用前景。

主权项

1.一种差动共焦拉曼光谱测试方法，实现本方法的装置包括激光器(1)、偏振分光镜(2)、1/4波片(3)、物镜(4)、聚光镜(8、10)、针孔(11、12)，探测器(13、14)、分光镜(5、6)、被测样品(7)、三维工作台(9)、聚焦信号差动相减处理单元(15)、光谱检测系统(16)、计算机处理系统(17)、光瞳滤波器(18)、滤光片(19)、扩束器(20)，其特征在于：首先通过差动共焦技术精确捕捉激发光束聚焦焦点位置，然后探测对应该位置的拉曼光谱；采用特定设计的光瞳滤波器，对差动共焦拉曼光谱仪器的光瞳函数进行掩膜修正，锐化爱里斑主瓣，进一步改善差动共焦拉曼光谱系统的微区光谱探测能力；通过差动共焦光路布置及差动探测来提高轴向分辨力，实现样品微区三维尺度及光谱特性的高信噪比检测；该方法的具体实现步骤如下：1)使可激发出样品拉曼光谱的激发光束透过偏振分光镜(2)、四分之一波片(3)、聚焦物镜(4)后，聚焦在被测样品(7)上，并激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；2)移动被测样品(7)，使激发光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片(3)并被偏振分光镜(2)反射，利用两分光镜(5、6)分光将偏振分光镜(2)反射的激发光和拉曼光谱分别进行分光；3)利用差动共焦显微系统的两个探测器(13、14)，分别探测分光镜(5)透射的光束，测得反映被测样品凸凹变化的强度响应IA(v，u，-uM)和IB(v，u，+uM)，并将IA(v，u，-uM)和IB(v，u，+uM)差动相减，得差动共焦强度响应I(v，u)，其中，v为横向归一化光学坐标，u为轴向归一化光学坐标，uM为针孔轴向归一化光学偏移量；4)利用光谱检测系统(16)检测分光镜(5)反射的光束，测得载有被测样品光谱信息的拉曼散射光谱I(λ)，其中λ为波长；5)使被测样品沿x、y向扫描，物镜(4)沿z向扫描，利用步骤3)和步骤4)所示的方法，测得对应物镜聚焦点位置附近的一组i个包含位置信息I(v，u)和光谱信息I(λ)的序列测量信息{Ii(λ)，Ii(v，u)}；6)利用可分辨区域σi对应的位置信息Ii(v，u)，找出对应σi区域的光谱信息Ii(λ)值，再依据v与横向位置坐标(x，y)的关系以及u与轴向位置坐标z的关系，重构反映被测物微区σi三维尺度和光谱特性的信息Ii(xi，yi，zi，λi)；即实现了微区几何尺寸(x，y，z)和光谱参数I(λ)的高精度检测；7)对应最小可分辨区域σmin的三维尺度和光谱特性可由下式确定：$I_{{\sigma }_{\min }}(x,y,z,\lambda )=I_i(x,y,z,\lambda ){|}_{I_i(v,u)=0,I_A(v,u,-u_M)\ne 0,I_B(v,u,+u_M)\ne 0}8)优化光瞳滤波器(18)参数，压缩激发聚焦光斑的尺寸，提高微区光谱探测能力。$