[发明专利]一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法

摘要

一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，它涉及了一种测定细菌产酶诱导物的方法。本发明解决了目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法。本发明测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行：一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备；四、各酶制备物与底物的反应；五、高效液相色谱；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。本发明的方法可明确细菌胞内产纤维素酶的胞内碳源诱导物。

主权项

1、一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，其特征在于测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行：一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用：在待测细菌的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5％，用4mL无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平行接入装有30mL发酵培养基的两个150mL三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min的速度进行振荡培养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离心15min，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及β-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备：用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min的速度振荡培养10h，按1％的体积比接入装有200mL增菌培养基的三角瓶中，在30℃的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末期，以1000r/min的速度离心10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入10mL、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约2～3mm，调节超声振荡器的输出功率为500W，工作30s，停30s，循环30次，再以1000r/min的速度离心10min，然后以20000r/min的速度离心20min，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于4℃透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为0.02％；四、各酶制备物与底物的反应：用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1∶1的体积比混合，将反应混合物放入37℃水浴反应24h，然后在0℃的条件下以16000r/min的速度离心30min，收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件：色谱柱为High Performance CarbohydrateColumn 4.6×250mm，流动相为的乙腈与按照75∶25的体积比混合的混合液，流速为1.4mL/min，检测器为示差折光检测器，上样量为15μL，每个样品平行操作三次；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。