[发明专利]一种栉孔扇贝基因的染色体定位方法

摘要

本发明涉及一种高效栉孔扇贝基因的染色体定位方法。首先利用气干法在载玻片上进行栉孔扇贝染色体制片；然后根据待定位基因序列，进行在线引物设计并合成引物；再对rRNA基因进行染色体定位：先利用连接酶处理载有染色体的载玻片，再对染色体进行甲酰胺变性处理，加入LAMP反应混合物，进行原位LAMP反应，反应结束后清洗载玻片，加入荧光标记的生物素抗体孵育，最后用碘化丙锭抗衰减溶液对染色体进行复染，利用稳定清晰的杂交信号确定目标基因在染色体上的位置。本发明方法使栉孔扇贝基因在恒温条件下能快速得到大量扩增产物，杂交信号清晰稳定，提高基因定位的准确性和特异性。对于定位单或低拷贝的基因，该方法也具有极大的应用潜力。

主权项

1、一种栉孔扇贝基因的染色体定位方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，首先将栉孔扇贝的担轮幼虫经0.01％的秋水仙素常温浸泡后，再用0.075M的氯化钾溶液浸泡30分钟，用新鲜配制的卡诺固定液固定3次，经过50％的醋酸溶液浸泡后，固定的幼虫被解离成细胞悬液，然后滴到60℃湿热的载玻片上，60℃风干；第二步，根据GenBank数据库内栉孔扇贝ITS2序列设计4条引物BIP，FIP，B3和F3；第三步，利用连接酶对载玻片上的染色体进行连接处理，再对载玻片上的染色体进行甲酰胺变性处理，并用-20℃的70％，90％和100％乙醇梯度脱水之后，风干，预热，然后将载玻片置于温度循环仪的加热板上，加入LAMP反应混和物，开始在载玻片上进行原位LAMP反应，反应结束后清洗载玻片，置于blocking缓冲液中孵育，再加入荧光标记的生物素抗体孵育，使生物素与抗体结合，最后用碘化丙锭抗衰减溶液对玻片上的染色体进行复染，用荧光显微镜对染色体进行观察和拍照，利用稳定清晰的杂交信号确定目标基因在染色体上的位置。