[发明专利]用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法

摘要

本发明公开了一种用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法，属于玻璃化冷冻保存领域。该方法的操作步骤如下：(一)液体配制；(二)玻璃化冷冻；(三)解冻。本发明的用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法与现有技术相比，具有成本花费低，方法简单，不需昂贵仪器，而且冷冻保存效果好、解冻后成活率高的特点。

主权项

1、用于家畜克隆的小量体细胞的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：(一)、液体配制：基础液：在100ml细胞培养液(DMEM液)中添加20ml-30ml胎牛血清(V/V)和0.5ml-1.5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic)；玻璃化冷冻液I：在100ml基础液中添加2ml-4ml乙二醇(V/V)和2ml-4ml二甲基亚砜(V/V)；玻璃化冷冻液II：在100ml基础液中添加30ml-35ml乙二醇(V/V)、30ml-35ml份二甲基亚砜(V/V)和0.2-0.3摩尔海藻糖；解冻液：在100ml基础液中添加0.25-0.35摩尔蔗糖；(二)、玻璃化冷冻：用6孔培养板培养细胞，待细胞汇合程度为80％-90％时先消化1孔细胞，用1.5毫升离心管收集细胞悬液，800g-1000g离心5-8分钟，去上清；接着加入1ml玻璃化冷冻液I，再800g-1000g离心5-8分钟，去上清；然后加入0.5ml玻璃化冷冻液II，混匀；之后，用移液器吸取2微升细胞悬液转移到一平皿的空白处；一支显微玻璃管插入其中，吸入液体至标记线处，立即将显微玻璃管投入液氮中储存；如此反复进行冷冻操作，细胞进入玻璃化冷冻液II的时间控制在1分钟内，超过1分钟，剩余细胞不再作冷冻处理；再消化1孔细胞，重复前面步骤，直至将所有孔内细胞冷冻保存；(三)、解冻：首先在一平皿中放置2ml解冻液，接着从液氮中取出1支显微玻璃管，将显微玻璃管标记线的一端插入解冻液中，用食指堵住另一端，利用手指的温度驱使细胞进入到解冻液中，停留3-5分钟；之后，用口吸管将细胞转移到装有2ml基础液的另一平皿中，停留3-5分钟；最后将细胞转移到进行核移植实验的平皿中即可。