[发明专利]利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法

摘要

本发明首次公开了一种利用大肠杆菌联产琥珀酸和PHB的方法，是敲除了大肠肝菌中的sdhAB和iclR基因，构建了琥珀酸好氧发酵途径，获得了琥珀酸发酵工程菌株MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan；在此基础上，将PHB合成途径导入大肠杆菌MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan中，从而在同一大肠杆菌中成功构建了琥珀酸和PHB发酵途径。发酵检测结果表明，该工程菌株可高效率地转化葡萄糖生成琥珀酸和PHB。消耗75g/L的葡萄糖，生成37.5g/L的琥珀酸，同时菌体积累PHB达到菌体干重的28％。该工程菌株具有重要的应用前景。

主权项

1.一种利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，步骤包括(1)在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径；(2)在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建PHB发酵途径；获得联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌；或者：(1)在大肠杆菌中构建PHB发酵途径；(2)在所构建PHB发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径；获得联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌；(3)发酵联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌并检测琥珀酸和PHB；其特征是：步骤(1)所述在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、Xl1-blue或W3110中敲除基因sdhAB和iclR，构建琥珀酸好氧发酵途径；步骤(2)所述在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建PHB发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes.latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，并转化到已构建有琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中，获得联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌；或者步骤(1)所述在大肠杆菌中构建PHB发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，获得PHB表达重组质粒并转化大肠杆菌MG1655、JM109、DH5α、Xl1-blue或W3110，得PHB发酵途径的大肠杆菌；步骤(2)所述在所构建PHB发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是将sdhAB和iclR基因敲除，获得联产PHB和琥珀酸的重组大肠杆菌；步骤(3)所述联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌的发酵条件是：摇瓶：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐：温度设为30～40℃，溶氧控制在50％以上，pH6.5～7.5，发酵时间72h～150h。