[发明专利]一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法

摘要

一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法。本发明利用双层平皿培养基和外加氮气的双重隔氧保护，通过甲烷菌属之间及与其他厌氧微生物在碳源利用上的特异性，限制性的加入有限的碳源，从而达到定向筛选分离不同甲烷菌的目的。本方法无需复杂昂贵的厌氧设备，操作简单可靠，使常规难以分离的特殊环境下的甲烷菌在实验室可快速定向分离得到，为深化甲烷菌的认识及开发其工艺应用潜能奠定了基础。

主权项

1. 一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法，其特征在于：1)将被分离样品中微生物浓度调节至0.5×107-1.5×107/ml；2)将上层选择性培养基和下层隔氧培养基于115℃蒸汽灭菌20min；3)将下层选择性培养基在无菌操作台倒入平皿中，其厚度为0.4-0.7cm，冷却凝固后，将预先调整好微生物浓度的样品取100ul均匀涂布在该培养基上；4)将上层隔氧培养基冷却到40℃左右，倒入涂有样品的上述平皿中，其厚度为0.6-0.7cm，冷却凝固后倒置于干燥器中；5)将干燥器密封后通入氮气，充气10min后于37℃恒温箱培养3-5天，可观察到甲烷菌单菌落；所述隔氧培养基是由水和重量体积为2-3％的琼脂粉构成的无营养基质；所述选择性培养基组成成份及含量为：NH4Cl：0.7-1.2g/l，MgCl2：0.08-0.14g/l，NaCl：17-22g/l，CaCl2：0.2-0.4g/l，K2HP04：0.3-0.5g/l，KH2P04：0.3-0.5g/l，酵母膏：0.8-1.2g/l，蛋白胨：0.8-1.2g/l，碳源1：甲酸钠：1.7-2.4g/l，碳源2：乙酸钠：1.7-2.4g/l，碳源3：甲醇：1.7-2.4g/l，蒸馏水：1000mL，琼脂：重量体积百分数为2-3％，pH：7.0—7.2，按1L选择性培养基加入微量元素母液1ml；所述微量元素母液组成为：FeCl3·4H2O：2000mg/l；CoCl2·6H2O：2000mg/l，MnCl2·4H2O：500mg/l，CuCl2.2H2O：30mg/l，ZnCl2：50mg/l，H3BO3：50mg/l，Na2SeO3·5H2O：100mg/l，NiCl2·6H2O：50mg/l，EDTA：1000mg/l，36％HCl：1ml。