[发明专利]多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用

摘要

本发明公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。向加入多环芳烃和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的土壤进行多环芳烃好氧降解微生物的富集与驯化，30d后向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入富集驯化的土壤。在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。本方法能够富集与驯化筛选到对多环芳烃具有好氧降解性能好的微生物菌群，对萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分别为：5.46mg·L^-1·d^-1；0.48mg·L^-1·d^-1；0.05mg·L^-1·d^-1及0.06mg·L^-1·d^-1。

主权项

1.一种多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：(1)选取受石油污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4℃冰箱中保存备用。(2)向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入25～30mL浓度为1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200∶10∶1∶1，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天。(3)向步骤(2)中开口玻璃瓶中加入500～600mL基础培养基，在转速为100r/min的条件下搅拌40～50min后加入步骤(1)中的土壤250g；然后置于温度为25～30℃的环境中在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养30d，在培养期间定期向玻璃瓶中加入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为：NH4Cl：1.5g·L-1，KH2PO4：1.5g·L-1，MgCl2：0.25g·L-1，CaCl2·2H2O：0.10g·L-1。(4)向体积为100～200mL的锥形瓶中加入10mL浓度为1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为200∶10∶1∶1，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天。(5)按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5∶1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为3∶1的比例用99％的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在温度为60℃的烘箱中放置2天。(6)向步骤(4)中的锥形瓶中入50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL维生素c溶液；其中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O：35mg·L-1，CuCl2：0.20mg·L-1，H3BO3：6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O：25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O：3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O：2.0mg·L-1，ZnCl2：2.5mg·L-1。(7)向步骤(6)中的锥形瓶内加入步骤(5)处理后的吸附剂0.35g，将其密封后放置在转速为100r/min的振荡器中平衡2天。(8)向步骤(7)中的锥形瓶内接入步骤(3)驯化的土壤0.25g，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养5～7天，每天打开瓶口一次以恢复锥形瓶内的溶解氧；按接种体积比为200～250∶1的比例转入另一按步骤(4)至(7)处理后的锥形瓶内，当转接次数大于8之后即可获得高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。