[发明专利]Survivin启动子调控人NIS基因的重组腺病毒及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种存活素(Survivin)启动子调控人钠碘同向转运蛋白基因(Sodiumiodide symporter，NIS)的重组腺病毒及其构建方法和应用。该方法通过将编码人NIS的核苷酸连接到广谱肿瘤特异性启动子Survivin启动子下游，并和多聚腺苷酸组成表达盒插入到腺病毒的非编码区，构建为重组腺病毒；利用该重组腺病毒可特异的在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞内基本不表达的特点，使不表达该蛋白的肿瘤细胞能够摄取放射性核素碘和锝，不仅可介导放射性核素特异性杀伤肿瘤细胞，同时也可方便简捷的通过显像技术对这种基因的定位和表达进行定量监测。

主权项

1. 一种Survivin启动子调控人NIS基因的重组腺病毒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：(1)Survivin启动子扩增：设计引物，以PC-3细胞的基因组DNA为模板，PCR扩增Survivin启动子片段，T/A克隆到PMD-18T载体，命名为PMD-Sur，并进行测序；(2)构建由Survivin启动子启动荧光素酶的报告质粒：BglII和HindIII双酶切PMD-Sur和pGL3-Basic质粒，胶回收262bp和4.8kb片段，连接转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，命名为pGL3-Sur-Luc；(3)人NIS基因的扩增：设计引物，以人甲状腺组织RNA为模版，RT—PCR扩增NIS片段，T/A克隆到pGEM-T Easy质粒载体，命名为pGEM-TEasy-NIS，并进行测序；(4)构建含有Survivin启动子，人NIS基因和SV40多聚腺苷酸的表达盒的重组腺病毒穿梭质粒载体：a)HindIII和XbaI分别双酶切pGL3-Sur-Luc质粒和pGEM-Teasy-NIS，胶回收为3.4kb和1.8kb的片段，连接转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，命名为pGL3-Sur-NIS；b)KpnI和SalI酶切腺病毒载体穿梭质粒pShuttle-1和pGL3-Sur-NIS，胶回收6.6kb条带和含有Survivin启动子+NIS+SV40PolyA加尾信号的表达元件条带，连接转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆，命名为pShuttle-Sur-NIS-PolyA；(5)生成重组腺病毒质粒pAd-Sur-NIS：PmeI线性化pShuttle-Sur-NIS-PolyA后与已转化到大肠杆菌BJ5183的骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，挑选阳性克隆，命名为pAd-Sur-NIS；(6)重组腺病毒Ad-Sur-NIS的包装、扩增和纯化：脂质体LipofectamineTM2000包裹重组病毒质粒pAd-Sur-NIS后转染293细胞，收集病毒并于293细胞扩增，氯化铯梯度离心纯化。