[发明专利]一种环境水体中肠道病毒的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种环境水体中肠道病毒的定量检测方法，该方法根据肠道病毒RNA5’非编码区保守序列的同源性，在已有的引物EV1和EV2的基础上，再设计一对肠道病毒通用引物EVN，制备了一系列梯度稀释的重组质粒作为标准品，建立了运用肠道病毒通用引物EVN的实时荧光定量PCR反应体系，定量检测环境水体中的肠道病毒含量。该方法定量准确、大幅度提高了现有的环境水体中肠道病毒定性RT－PCR检测技术的灵敏度，线性范围宽广，精密度高，具有良好的特异性，与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应。

主权项

1.一种环境水体中肠道病毒的定量检测方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一，肠道病毒通用引物EVN设计：根据肠道病毒RNA5’非编码区保守序列的同源性，在已有的引物EV1和EV2的基础上，再设计一对肠道病毒通用引物EVN，该肠道病毒通用引物EVN包括上游引物EVN1和下游引物EVN2，其中，上游引物EVN1的核苷酸序列为：5′-ACTTCGAGAAGCCTAGTACC-3′；下游引物EVN2的序列为：5′-TAGGATTAGCCGCATTCAG-3′；步骤二，标准品的制备：将脊髓灰质炎病毒接种到Vero细胞中，当细胞病毒达到3+～4+时，收集病变细胞，提取样品中的RNA，以EV2为引物，加入AMV逆转录酶进行逆转录，逆转录产物置于-20℃保存；以逆转录产物为模板，EV1和EV2为引物，进行PCR扩增，将所得的目的产物片段回收纯化，与pMD18-T载体连接转化至大肠杆菌中，用平板筛选出阳性菌落，在含有Amp的LB液体培养基中培养，提取质粒进行序列测定，再用紫外分光光度计定量，梯度稀释后-20℃保存作为荧光实时定量PCR的标准品；利用2.31GEC/μL～2.31×109GEC/μL十个浓度梯度的重组质粒作为模板，按照测定程序进行实时荧光定量PCR，每个浓度的样品测定5次，取平均值进行回归，得到标准曲线方程：CT＝-3.6896logX0+42.987(R2＝0.997) (式1)式中：X0——初始模板量(GEC)水样中的肠道病毒含量：40X0(GEC) (式2)步骤三，定量检测：1)样品采集：在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰盒内保存；2)病毒的初步浓缩：将混合纤维素酯滤膜装入真空抽滤器，过滤含有肠道病毒的水样，用牛肉膏-甘氨酸缓冲液作为洗脱剂进行膜洗脱，收集洗脱液；3)二次浓缩：在洗脱液中加入PEG和NaCl，4℃静置过夜搅拌混匀，在4℃下静置沉淀过夜，离心，收集沉淀；4)RNA提取：利用RNA提取试剂盒，从沉淀提取病毒RNA；5)逆转录：将13μL RNA和1μL 25μmol/L EV2引物混匀，加入AMV逆转录酶，70℃水浴10min，冰浴10min，瞬时离心后，加入2μL 10×RTbuffer，2μL dNTP mixture(共40mmol/L)，10U RNA酶抑制剂和5U AMV酶，43℃水浴1h，70℃水浴10min，离心，获得逆转录产物作为PCR模板；6)实时荧光定量RT-PCR检测：取2×SYBR Mix 12.5μL，10μmol/L上游引物EVN1和10μmol/L下游引物EVN2各0.5μL，2μL 25mmol/L MgCl2，Taq酶2U，加入模板2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在实时定量PCR仪上进行扩增及结果分析；反应条件为：①94℃预变性4min；②扩增循环40次：94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；③在85℃收集荧光信号，循环结束后进行熔解曲线分析，从65℃以0.2℃/s速率升温至95℃，整个过程中持续检测荧光；7)计算：根据检测所得的CT值，代入标准曲线方程的式1中计算肠道病毒的初始模板量，然后代入式2中即可计算样品中肠道病毒的含量。