[发明专利]褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼鳍组织为材料，采用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％Ⅱ型胶原酶联合消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、Ⅰ型胰岛素样生长因子和羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼细胞系，目前已传至第61代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究。

主权项

1.一种褐点石斑鱼鳍细胞系的构建方法，首先对鲜活褐点石斑鱼分别用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水和75％酒精消毒处理，置于超净工作台中取下鳍组织，以75％酒精再次消毒，磷酸缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；用浓度为0.5％透明质酸酶和0.2％II型胶原酶对鳍组织块联合消化1～2小时，并离心收集鳍组织块；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于25毫升培养瓶中，24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天半量更换褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液一次；待褐点石斑鱼鳍细胞长成单层后，使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，经褐点石斑鱼鳍细胞专用培养液悬浮后，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳍细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液，并添加占该培养液0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖。