[发明专利]来自威廉腔环蚓的蚯蚓纤溶酶制备方法及其冻干粉针制剂

摘要

本发明公开了一种来自威廉腔环蚓的蚯蚓纤溶酶的制备方法及由其制备的静脉注射用冻干粉针制剂。本发明通过羧甲基-琼脂糖凝胶C1-6B柱和凝胶柱层析实现了蚯蚓纤溶酶的分离纯化，从而得到了较高纯度的来自威廉腔环蚓的蚯蚓纤溶酶，该方法得到的蚯蚓纤溶酶的分子量为28000～30000道尔顿，其比活达到每毫克蛋白10万单位。同时本发明将其为原料制成用于注射的冻干粉针剂，用于血栓性疾病的治疗。

主权项

1、来自威廉腔环蚓的蚯蚓纤溶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)蚯蚓纤溶酶粗品提取：取新鲜蚯蚓用水洗净，在4℃±1℃低温下，加入蚯蚓1-5倍重量份的pH6～8的含有0.1mol/LNaCl的0.01～0.1mol/L缓冲液，捣碎匀浆，抽提2～5小时，然后4000～6000转/分钟，离心10～30分钟，取上清液，加入硫酸铵至60％～80％饱和度，于4℃±1℃放置过夜，4000～6000转/分钟，离心10～30分钟，取沉淀物，透析除盐，冷冻干燥，得到蚯蚓纤溶酶粗品；(2)蚯蚓纤溶酶粗品的纯化：将步骤(1)中的蚯蚓纤溶酶粗品用pH6～8的0.01～0.1mol/L缓冲液溶解，4000～6000转/分钟，离心10～30分钟，取上清液用羧甲基-琼脂糖凝胶Cl-6B柱分离，用氯化钠直线梯度方式洗脱，该氯化钠溶液的浓度从0mol/L线性递增至1mol/L，收集各洗脱峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥，经活性检测，得到蚯蚓纤溶酶纯化产品；(3)蚯蚓纤溶酶纯化产品的精制：将步骤(2)中的蚯蚓纤溶酶纯化产品用pH6～8的0.01～0.1mol/L缓冲液溶解，用凝胶柱分离，用pH6～8的0.01～0.1mol/L缓冲液洗脱，收集活性洗脱峰的洗脱液，透析除盐，冷冻干燥，得到蚯蚓纤溶酶精制品，其分子量为28000～30000道尔顿，所述蚯蚓纤溶酶的比活达到每毫克蛋白10万单位。