[发明专利]黄鳝抗菌肽的制备工艺及应用

摘要

本发明是一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特点是，其步骤如下：黏液制备：黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；将黄鳝皮肤黏液制备上清液、干粉，再进行一次筛选，获得4个分离峰；然后再进行二次筛选，筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS－IV；然后对MAS－IV进行三次筛选，筛选得到最终得到目标产物MAS－IV－3、MAS－IV－4黄鳝抗菌肽；MAS－IV－3、MAS－IV－4黄鳝抗菌肽对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。

主权项

1、一种黄鳝抗菌肽的制备工艺，其特征在于，其步骤如下：(1)黏液制备：黄鳝放入水中排除体内杂物后，将黄鳝分别置于标本缸中，撒适量氯化钠于黄鳝体表刺激黄鳝蠕动，收集黄鳝皮肤黏液；(2)上清液制备：将黄鳝皮肤黏液于4℃、12000rpm高速冷冻离心20min，取上清液，然后将上清液以厚度不超过2mm分装于若干培养皿中，再用保鲜膜封盖，-40℃冷冻保存备用；(3)干粉制备：取-40℃冷冻保存24h以上的上述培养皿，在封盖保鲜膜上扎若干个孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓缩，获黄鳝皮肤黏液的干粉；(4)一次筛选：称取干粉5-10g，5-10mL PBS缓冲液溶解，-4℃离心15min，取上清液为样品；测定样品A280；然后选用2.6cm×100cm层析柱，Sephadex G-50填料，pH 6.0、0.1mol/L PBS洗脱液，按常规方法用Sephadex G-50装柱后，以6s一滴的速度平衡柱子24h，将总OD为200-300的样品滴加至Sephadex G-50凝胶柱表面，让样品自然或6s一滴的速度流入Sephadex G-50凝胶柱中；安装好层析系统，以10s一滴的速度洗脱，自动收集器收集，得每管3mL的按序编号的收集管若干；测定各收集管中A280和A220，以收集管序号为横坐标、A280和A220为纵坐标，制作分离图谱，获得4个分离峰，分别命名为MAS-I、MAS-II、MAS-III和MAS-IV；(5)二次筛选：采用抑菌圈法进行抑菌实验筛选；实验用指示菌为嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和鲁克氏耶尔森菌；将上述7种菌种制备成A600＝0.06的菌悬液，取100μL涂布于LB培养基上，用微量移液器取20μL分离液浸润滤纸，将滤纸片放于涂布菌悬液的培养基上；筛选得到对大肠杆菌、嗜水气单胞菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑菌效果的MAS-IV：(6)MAS-IV溶液透析：12000r/min，4℃离心MAS-IV5min，取出上清液，放入透析袋中，用Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.8)透析2-4h，中间更换缓冲液1-2次；(7)MAS-IV离子交换层析：选用12mm×200mm层析柱，DEAE SepharoseFast Flow填料，Biologic Duoflow蛋白质层析系统，利用含0.8mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，NaCl浓度从0％-100％，洗脱5个柱体积，流速1.00mL/min；根据Biologic Duoflow蛋白质层析系统配套软件显示的分离峰，分别收集7个分离峰，并依次命名为MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7；(8)MAS-IV离子交换层析产物的浓缩：将MAS-IV-1，MAS-IV-2，MAS-IV-3、MAS-IV-4、MAS-IV-5、MAS-IV-6和MAS-IV-7分别分装于培养皿中，厚度不超过2mm，并用保鲜膜封盖，置-40℃冰箱冷冻；24h后取出培养皿，在封盖保鲜膜上扎孔，即时用真空冷冻干燥机对其进行冷冻干燥浓缩，获各分离峰干粉；(9)三次筛选：采用步骤(5)中所述的方法进行再一次的筛选用抑菌实验；用适量无菌水溶解上述各分离峰干粉制成样品液；筛选得到MAS-IV-3、MAS-IV-4对嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌活性；最终得到目标产物MAS-IV-3、MAS-IV-4黄鳝抗菌肽。