[发明专利]ppGalNAc-T18特异性多克隆抗体的制备方法

摘要

一种生物技术领域的ppGalNAc-T18特异性多克隆抗体的制备方法，其具体步骤为：通过序列比对确定抗原序列，构建pGEX-5X-1-shortT18重组表达质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在BL21(DE3)中表达目的蛋白，纯化得到重组蛋白，之后用纯化的蛋白免疫家兔，取血离心得到相应的抗血清，对抗血清纯化得到ppGalNAc-T18抗体。该抗体不与ppGalNAc-T18同源性极高的蛋白发生交叉反应，可用于细胞免疫荧光、Western Blotting检测。

主权项

1、一种ppGalNAc-T18特异性多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、对ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白质序列进行比对，确定抗原序列shortT18；步骤二、根据抗原序列和质粒多克隆位点设计引物，从ppGalNAc-T18全长基因PCR产物中得到目的片段；目的片段经Sal I、Not I双酶切，割胶回收，用连接酶连接入经Sal I、Not I双酶切的pGEX-5X-1空载体，构成pGEX-5X-1-shortT18原核表达载体并转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选培养；挑单菌落，抽提质粒，测序；步骤三、将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；步骤四、培养转化重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)；步骤五、诱导培养的大肠杆菌BL21(DE3)；步骤六、收集诱导后的菌体，用缓冲液振荡混匀，超声波破碎，离心并收集上清；步骤七、纯化得到的蛋白上清；步骤八、用纯化的蛋白对家兔进行进行免疫，取血，离心得到抗血清；步骤九、纯化抗血清，得到ppGalNAc-T18抗体。