[发明专利]基于基因置换技术的活菌内标的制备方法有效
| 申请号： | 200810202295.5 | 申请日： | 2008-11-06 |
| 公开（公告）号： | CN101397587A | 公开（公告）日： | 2009-04-01 |
| 发明（设计）人： | 史贤明;龙飞;施春雷;朱欣娜;张忠明 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12N1/21;C12R1/01 |
| 代理公司： | 上海交达专利事务所 | 代理人： | 王锡麟;王桂忠 |
| 地址： | 200240*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明是一种生物技术领域的基于基因置换技术的活菌内标的制备方法。包括：(1)上下游在基因置换过程中与目标基因发生双交换DNA的同源重组序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列的选择和相应酶切位点的设计；(2)含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备；(3)同源重组质粒的电转化感受态单核细胞增生李斯特菌及相应电转化后出现了供体性状的受体细胞转化子的筛选；(4)发生基因置换的单核细胞增生李斯特活菌内标的筛选；(5)通过在待检测样品中添加活菌内标等来验证所制备的扩增内标。本发明避免了由这些抑制成分所导致的假阴性现象的发生，从而大大提高了微生物荧光定量PCR检测的准确率。 | ||
| 搜索关键词： | 基于 基因 置换 技术 活菌内 标的 制备 方法 | ||
【主权项】：
1、一种基于基因置换技术的活菌内标的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)上下游在基因置换过程中与单核细胞增生李斯特菌hly目标基因发生双交换DNA的同源重组序列、扩增内标序列和卡那霉素抗性基因序列的选择和相应酶切位点的设计；(2)含上下游同源序列、内标序列和卡那霉素抗性基因的同源重组质粒pKSV7-UIKD的制备；(3)同源重组质粒的电转化感受态单核细胞增生李斯特菌及相应电转化后出现了供体性状的受体细胞转化子的筛选；(4)发生基因置换的单核细胞增生李斯特活菌内标的筛选；(5)通过在待检测样品中添加活菌内标与目标菌共同经历增菌培养、菌体收集、DNA提取和PCR扩增来验证所制备的扩增内标。
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