[发明专利]一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法

摘要

本发明涉及一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法。本发明提供了一种检测稻瘟病菌侵染水稻后不同时间点致病相关基因表达量的方法，该方法的技术方案是：将稻瘟病菌孢子喷雾接种到水稻叶片上，取样并提取总RNA，应用SYBR Green I嵌合荧光法对稻瘟病菌致病相关基因片段进行实时荧光定量PCR检测，记录待测样品的C(t)值，根据公式计算其致病相关基因片段的表达量。采用本方法可快速准确地检测水稻接种稻瘟病菌早期不同时间段稻瘟病菌致病相关基因的表达量；分析不同致病相关基因在不同水稻品种中的表达量及其在接种后不同时间段的变化情况；分析稻瘟病菌致病相关基因的时空表达模式等。其检测结果准确、重复性好，有助于说明这些基因的功能。

主权项

1、一种检测稻瘟病菌致病相关基因在侵染的水稻叶片组织中表达量的方法，其步骤为：(1)液体培养稻瘟病菌并提取其菌丝体的总RNA，并将其中的mRNA反转录成cDNA；(2)将稻瘟病菌的孢子接种到水稻植株叶片上，并在接种后早期的不同时间段24h、48h、72h、96h和168h提取侵染组织的总RNA并将其中的mRNA反转录成cDNA；(3)选择稻瘟病菌MG03982.5肌动蛋白actin基因作为内参基因，并根据该基因和稻瘟病菌致病相关基因：MGS0274.1、MGS0338.1和MGS1460.1的cDNA序列，按照实时荧光定量PCR引物原则设计特异性引物，引物如下：引物编号 引物序列(5′-3′) PCR产物长度MG03982.5(actin) F：GTCGCTCTTGACTTTGAGCAR：ATACCACCGCTCTCAAGACC 109bpMGS0274.1F：GATCCATGCGTCACAATCAGR：GAGATGAATAACCGCGGACA 117bpMGS0338.1F：GTCAACGAGGCGCATCTACTR：GCACTCGCCATTCTGGATCT 123bpGS01460.1F：GTGCCGCCTCAATATACGACR：ACCGCCTTGTGAGGACTTAG 105bp(4)实时荧光定量PCR的反应体系为：采用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR，PCR混合液总体积为20μl，包括iQ SYBR GreenSupermix10μl，正向引物(F)1μl，反向引物(R)1μl，cDNA模板或梯度稀释成不同浓度的质粒DNA5μl，灭菌双蒸水3μl；(5)实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环；72℃延伸10min；55℃-95℃缓慢升温，产生熔点曲线；(6)各cDNA样品分别以上述引物进行定量PCR反应得到检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；并分别以看家基因及致病相关基因的Ct值计算致病相关基因相对表达水平；其计算公式为：基因表达倍数＝2-△△Ct△△Ct＝[Ct目的基因(未知样品)—Ct内参基因(未知样品)]—[Ct目的基因(对照样品)—Ct内参基因(对照样品)]对照样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。