[发明专利]从精浆中提取胞外RNA的方法无效

专利信息
申请号: 200810236894.9 申请日: 2008-12-19
公开(公告)号: CN101747398A 公开(公告)日: 2010-06-23
发明(设计)人: 李红钢;熊承良 申请(专利权)人: 华中科技大学
主分类号: C07H21/02 分类号: C07H21/02;C12N15/10
代理公司: 华中科技大学专利中心 42201 代理人: 夏惠忠
地址: 430074 湖北*** 国省代码: 湖北;42
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摘要: 发明提供了一种从精浆中提取胞外RNA的方法,包括将收集和分离精浆、对精浆进行两次变性液处理、用异丙醇和乙醇沉淀和洗涤RNA等步骤,该方法结合精液的生物化学特点和胞外RNA的特点,有针对性地选择和组合RNA提取试剂,针对精浆中含丰富的蛋白质,在变性液中加入了N-十二烷基肌氨酸钠,以促进硫氰酸胍对蛋白质的变性作用;针对胞外RNA一般与某种物质结合的特点,在变性液中加入了Triton X-100,有利于RNA与所结合物质的分离。该方法成本低廉、结果可靠、易于推广应用,所提取的胞外RNA含量高、质量好,为一种无创性的手段,可替代现行的穿刺方法而应用于男性生殖器官基因表达研究和器官功能检测、评定。
搜索关键词: 精浆中 提取 rna 方法
【主权项】:
一种从精浆中提取胞外RNA的方法,包括以下步骤:(1)配制组份及终浓度如下的变性液A:50mmol/L柠檬酸钠.2H2O(pH 7.0)8mol/L硫氰酸胍1%N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)2%(v/v)Triton X-1000.2mol/L β-巯基乙醇(临用前加,每ml加14.4mol/Lβ-巯基乙醇14ul)在临用前,按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul;(2)取1ml高速离心后精浆,置5ml离心管中,加入等体积变性液A,用吸头吹打混匀;(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml,每加一种后倒置混匀,全部加完后剧烈振荡30秒;(4)冰浴15分钟;(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟;(6)小心吸取上清入另一离心管中,向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇,用吸头吹打混匀,置-20℃沉淀1小时;(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟;(8)配制组份及终浓度如下的变性液B:300mmol/L乙酸钠(pH 5.2)4mol/L硫氰酸胍(9)弃上清,收集沉淀,加入0.5ml变性液B溶解沉淀,沉淀溶解后移入1.5ml离心管中;(10)加入0.5ml预先冷藏的异丙醇,用吸头吹打混匀,置-20℃沉淀1小时;(11)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟;(12)弃上清,向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75%乙醇1ml,用吸头吹打使沉淀溶解;(13)在离心力为12000g和4℃条件下离心5分钟;(14)弃上清,干燥5分钟,向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀,即为所提取的精浆胞外RNA。
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