[发明专利]微克隆库的建立方法

摘要

分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的研究工作。显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种。

主权项

分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作，显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种：(1)酶切直接克隆法该法是在PCR技术之前使用的主要方法，其过程为首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库，该方法的优点是克隆片段相对较大，不足是技术复杂、操作精细，为满足微克隆对DNA模板量的要求，需要分离100～200条同一染色体片段，Saudery第一次将微切割和微克隆技术应用于植物中，他们用微细玻璃针分离黑麦B染色体，并在油室中消化、连接等微克隆操作，得到一个区别于A组染色体的克隆，插入序列为2kb；(2)PCR介导的微克隆技术目标染色体经显微切割、分离得到的染色体数量有限，往往通过PCR扩增以得到更多的产物以用于后续研究，常用的PCR方法主要有以下两种，连接体-结合体介导的PCR(Linker-adaptor-PCR，LA-PCR)，LA-PCR即将分离的染色体DNA用限制性内切酶进行消化，根据酶切后产生的粘性末端的碱基序列，分别设计一个连接体(linker)和一个结合体(adaptor)，并使linker与adaptor混合后产生与某一内切酶同样的粘性末端。由于粘性末端不受限制，当酶切后的染色体DNA与连接体-结合体混合后，可大大提高连接效率，再用其中的连接体作PCR扩增的引物，由于每个酶切产物都连接一个已知的连接体(引物)，这样就可扩增任一未知DNA片段，在PCR反应前无需分离程序，所构建的染色体区带特异性文库不仅避免了分离等步骤，减少了产生污染的可能，而且由于DNA丢失少而极大提高了文库的完整性，兼并引物PCR(Degenerate Oligonucleotid Primed-PCR，DOP-PCR，)，DOP-PCR即用一个简单的简并引物，经两次PCR反应来扩增(第一次复性温度低)，利用DOP-PCR技术扩增显微切割的染色体DNA，无需进行染色体DNA的限制性酶切、设计连接接头等步骤，直接以染色体DNA为模板，具有快速、高效的特点，DOP-PCR扩增产物既有高度重复序列，也有低拷贝序列，利用DOP-PCR技术，已成功对微切割的番茄第二染色体(Arumuganathan等，1994)、小麦5BL染色体等进行了扩增。