[发明专利]切割来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

摘要

I-CreI变体，其中两个I-CreI单体之一具有至少两个替换，在LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域(分别位于I-CreI的26～40位以及44～77位)中各含一个，所述变体能够切割来自小鼠ROSA26基因座的DNA靶序列。所述变体及其衍生产物用于改造表达异源目的蛋白之转基因小鼠和重组小鼠细胞系的用途。

主权项

I-CreI变体，其特征在于两个I-CreI单体之一具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各含一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的26～40位和44～77位，所述变体能够切割来自小鼠ROSA26基因座的DNA靶序列，并可通过至少包括下述步骤的方法获得：(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的26～40位，(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44～77位，(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，其中至少(i)所述I-CreI位点中-10～-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-10～-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8～+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-10～-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，其中至少(i)所述I-CreI位点中-5～-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-5～-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3～+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-5～-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，其中至少(i)所述I-CreI位点中+8～+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+8～+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10～-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+8～+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，其中至少(i)所述I-CreI位点中+3～+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+3～+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5～-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+3～+5位的核苷酸三联体的反向互补序列，(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两种变体中26～40位和44～77位的突变组合在单个变体中，以获得切割以下序列的新同二聚体I-CreI变体，所述序列(i)-10～-8位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-10～-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8～+10位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-10～-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5～-3位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-5～-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3～+5位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中-5～-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两种变体中26～40位和44～77位的突变组合在单个变体中，以获得切割以下序列的新同二聚体I-CreI变体，所述序列(i)+3～+5位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+3～+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5～-3位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+3～+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点的+8～+10位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+8～+10位的核苷酸三联体相同，和(iv)-10～-8位的核苷酸三联体与存在于所述来自小鼠ROSA26基因座之DNA靶序列中+8～+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(i)将步骤(g)和/或(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自小鼠ROSA26基因座之所述DNA靶序列的异二聚体。