[发明专利]切割来自人血红蛋白β基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

摘要

本发明涉及一种I-CreI变体，其中两个I-CreI单体之一具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各含一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的26到40位以及44到77位，所述变体能够切割来自人β珠蛋白基因的DNA靶序列。本发明还涉及所述变体和衍生产物用于预防和治疗人β珠蛋白基因中突变所引起的病理状况(镰状细胞病，β-地中海贫血症)的用途。

主权项

I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各含一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的26到40位和44到77位，所述变体能够切割来自人β珠蛋白基因的DNA靶序列，并可通过至少包含下述步骤的方法获得：(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的26到40位，(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列，(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体被替换为存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，和(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(i)将步骤(g)和/或(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自人β珠蛋白基因的所述DNA靶序列的异二聚体。