[发明专利]制造雄烯二酮的组合物和方法

摘要

本发明提供生产提高纯度的雄烯二酮(4-雄烯二酮)和调节其生产的组合物和方法，例如通过缺失或失活ksdA、cxgA、cxgB、cxgC或cxgD。本发明也提供用于生产1，4-雄二烯-3，17-二酮(ADD)和相关途径化合物的方法和组合物，所述组合物包括编码酶的核酸，所述相关途径化合物包括20-(羟甲基)孕-4-烯-3-酮和20-(羟甲基)孕-1，4-二烯-3-酮。本发明的组合物包括核酸、探针、载体、细胞、转基因植物和种子、转基因动物、试剂盒和阵列。

主权项

分离的、合成的或重组的核酸，其包括：(a)编码多肽的核酸序列，所述序列具有与SEQ ID NO：1至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全的(100％)序列同一性，和所述多肽具有KsdA多肽或3 甾酮 Δ1 脱氢酶活性；(b)编码多肽和其酶活性片段的核酸序列，所述多肽具有SEQ IDNO：2中所列的氨基酸序列，并具有KsdA多肽或3 甾酮 Δ1 脱氢酶活性；(c)编码多肽的核酸序列，所述序列具有与SEQ ID NO：9至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全的(100％)序列同一性，和所述多肽具有CxgA多肽或乙酰辅酶A 乙酰转移酶/硫解酶活性；(d)编码多肽和其酶活性片段的核酸序列，所述多肽具有SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11中所列的氨基酸序列，并具有CxgA多肽或乙酰辅酶A 乙酰转移酶/硫解酶活性；(e)编码多肽的核酸序列，所述序列具有与SEQ ID NO：17至少大约75％、76％、77s％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全的(100％)序列同一性，和所述多肽具有CxgB多肽或DNA 结合蛋白活性；(f)编码多肽和其DNA 结合活性片段的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：18中所列的氨基酸序列，并具有CxgB多肽或DNA 结合蛋白活性；(g)编码多肽的核酸序列，所述序列具有与SEQ ID NO：24至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全的(100％)序列同一性，和所述多肽具有CxgC多肽或DNA 结合蛋白活性；(h)编码多肽和其酶活性片段的核酸序列，所述多肽具有SEQ IDNO：25中所列的氨基酸序列，并具有CxgC多肽或酰基 辅酶A脱氢酶/FadE活性；(i)编码多肽的核酸序列，所述序列具有与SEQ ID NO：31至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多、或完全的(100％)序列同一性，和所述多肽具有CxgD多肽或TetR样调节蛋白/KstR活性；(j)编码多肽和其酶活性片段的核酸序列，所述多肽具有SEQ IDNO：32中所列的氨基酸序列，并具有CxgD多肽或TetR样调节蛋白/KstR活性；(k)(a)至(j)任一项所述的核酸，其中所述序列同一性通过序列比较算法分析或通过视觉观察测定；(l)(k)所述的核酸，其中所述序列比较算法是BLAST版本2.2.2算法，其中过滤设置设定为blastall p blastp d″nr pataa″ F F和所有其它选项设定为默认，或者是使用默认参数的FASTA版本3.0t78；(m)在严格条件下与由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：24和/或SEQ ID NO：31组成的核酸杂交的核酸序列，且所述核酸分别编码具有KsdA多肽或3 甾酮 Δ1 脱氢酶活性、CxgA多肽或乙酰辅酶A 乙酰转移酶/硫解酶活性、CxgB多肽或DNA 结合蛋白活性、CxgC多肽或酰基 辅酶A脱氢酶/FadE活性、或CxgD多肽或TetR样调节蛋白/KstR活性的多肽，其中所述严格条件包括包含在约65℃的温度、在0.2X SSC中洗涤约15分钟的洗涤步骤；(n)(a)至(m)任一项所述的核酸，其编码缺少信号序列或蛋白原序列、或缺少同源启动子序列的多肽；(o)(a)至(n)任一项所述的核酸，其还包括编码异源氨基酸序列的序列，或所述核酸还包括异源核苷酸序列；(p)(o)所述的核酸，其中所述异源氨基酸序列包括或由编码异源(前导)信号序列、或标记物或表位的序列组成，或者所述异源核苷酸序列包括异源启动子序列；(q)(o)或(p)所述的核酸，其中所述异源核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，该信号序列包括或由靶向内质网(ER)或内膜或靶向细菌内质网(ER)或内膜系统的N 端和/或C 端突出组成，或所述异源序列编码限制位点；(r)(p)所述的核酸，其中所述异源启动子序列包括或由以下组成：组成型或诱导型启动子，或细胞型特异性启动子，或植物特异性启动子、或细菌特异性启动子或分支杆菌属特异性启动子；(s)(a)至(r)任一项所述的核酸，其中所述酶活性是耐热的；或(t)与(a)至(s)任一项所述的核苷酸序列完全互补的核酸序列。