[发明专利]一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法

摘要

本发明涉及一种2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析方法，采用优化的考马斯亮蓝定量蛋白法(Bradford法)，通过配制磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝G-250染色剂，在牛血清蛋白质标准溶液中加入考马斯亮蓝G-250染色剂，根据考马斯亮蓝与蛋白质结合后的吸光度增加值绘制标准曲线，然后取2-酮基-L-古龙酸加入考马斯亮蓝试剂，根据吸光度增加值与蛋白质浓度标准曲线斜率计算出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。该分析方法简便、灵敏，稳定性好，准确率高，重现性好，对检测设备要求低，非常适宜于工业生产中2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析检测。对保证和指导正常生产具有重大的意义。

主权项

1、一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)配制磷酸盐缓冲液(pH7.0)：取磷酸二氢钾加氢氧化钠溶液配置pH为7.0的磷酸盐缓冲液，用水稀释至100ml；(2)配制0.1mg/ml牛血清蛋白质标准溶液：称取牛血清蛋白，用少量蒸馏水溶解定容至100ml，得到1mg/ml蛋白质溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步骤(1)的磷酸盐缓冲液，去离子水定容，即得0.1mg/mL蛋白质标准液，冰箱中保存，待用；(3)配制考马斯亮蓝G-250染色剂，0.1g考马斯亮蓝G-250，50ml 95％乙醇，100ml 85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08.、0.1mg/ml的牛血清蛋白质标准溶液，分别移取1ml的牛血清蛋白质标准溶液至5支试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250染色剂，制作595nm处考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸光度增加值(ΔA(595))与蛋白质浓度(c，mg/mL)关系标准曲线；(5)供试品溶液的配制：①2-酮基-L-古龙酸干品：称取5g 2-酮基-L-古龙酸干品，用去离子水将其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml 20％KOH稀碱溶液和10mlpH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；②2-酮基-L-古龙酸钠醪液：2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管中，然后加入2ml40％KOH稀碱溶液，沸水中煮30min，去离子水将其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，调节供试品pH，去离子水定容；(6)测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量：分别移取1ml去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5ml去离子水，120min内分别测定三支试管中的溶液和去离子水在595nm处吸光度；吸光度的增加量ΔA(595)＝A2-A1-A3+A0，其中A0为去离子水的吸光度，A1为1ml去离子水和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A2为1ml供试品和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光度，A3为1ml供试品和5ml去离子水的吸光度；根据吸光度增加值(ΔA(595))与蛋白质浓度(c，mg/mL)标准曲线斜率得出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。