[发明专利]猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法

摘要

本发明涉及一种猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，该方法是利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成，快速检测猪血液或血清中的抗体。该测试纸条可广泛用于临床猪圆环病毒病的检测。与其他病毒无交叉反应，与ELISA、中和试验两种方法检测的符合率分别为98.63％和95.83％。与ELISA相比，重组抗原免疫胶体金具有明显的优势：安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一，操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。

主权项

猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，利用基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制成快速检测猪血液或血清中的抗体，猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和PVC板，按照顺序固定在PVC板上，PVC板一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了基因工程表达的猪圆环病毒2型ORF2蛋白-胶体金结合物，将表达蛋白包被在硝酸纤维膜作为检测线(T)，将免抗猪圆环病毒2型抗体包被在硝酸纤维膜作为对照线(C)，制备步骤如下：一、基因工程表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白制备1)材料和方法：1.1ORF2基因氨基端737-421nt的扩增：参照PCV2JXL序列，设计并合成1对引物，以重组质粒pMDT-PCV为模板，扩增ORF2基因的氨基端(737-421nt)部分片段。CapL 5’AGC AAG CTT CTT TCG TTT TC3’，PCVF 5’GGG AAT TCA ACC TTA ATC TTC CTT A 3’上游引物下划线为HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下划线为EcoRI序列，位于423nt；PCR反应条件为，94℃热启动5分钟，94℃变性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分钟，扩增产物即为PCV737-421，经1％琼脂糖电泳；1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆：将扩增产物PCV737-421利用胶回收试剂盒大量回收，利用T-A原理，与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布于含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB片板，12小时后挑取典型白色单菌落少量培养，提质粒DNA。通过BamHI和EcoRI双酶切鉴定重组克隆，命名为pMDT-PCV737-421；1.3ORF2基因氨基端737-421nt在pGEX-6p-1中的克隆：原核表达载体pGEX-6p-1是上游带有谷胱甘肽S转移酶GST部分基因的高效表达载体，用BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pMDT-PCV737-421，得到2条条带，分别为载体2.7kb和插入片段0.3kb，回收其中0.3kb，用BamHI和EcoRI双酶切pGEX-6p-1，与带有相同粘端的PCV737-421连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落少量培养基过夜培养，小提质粒DNA，通过限制性内切酶鉴定重组质粒，得到重组克隆命名为pGEX-PCV737-421；1.4ORF2基因羧基端421-37nt在pGEX-6p-1中的克隆：利用pMDT-Cap重组克隆中分别位于引物和载体序列的EcoRI和SalI位点，用EcoRI和SalI双酶切DNA pMDT-Cap，得到2条带，分别为3.0kb和0.4kb，其中3.0kb来自2.7kb的载体带与ORF2基因的氨基端737-421部分之和，0.4kb条带，即为ORF2基因的羧基端421-37nt部分PCV421-37，大量回收，与同样用EcoRI和SalI双酶切的pGEX-6p-1载体连接，转化大肠杆菌BL21感受态菌，常规筛选重组克隆，得到pGEX-PCV421-37；1.5pGEX-PCV737-421和pGEX-PCV421-37的诱导表达：按照载体说明书GST Gene Fusion System，第3版进行，将分别含有重组质粒pGEX-PCV737-421和pGEX-PCV421-37的新鲜大肠杆菌单菌落在2×YTA培养基中37℃振荡培养过夜，次日按1％体积比转接5ml新鲜培养基，37℃继续培养，当菌液OD600值达0.6-0.8时，加入无菌IPTG溶液，使终浓度为0.1mmol/L。诱导3-4小时后停止培养，取1ml离心收集菌体，PBS(pH7.4)洗涤，用80μl PBS悬浮菌体，与20μl 5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟。利用BioRAD公司的蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色；1.6pGEX-PCV737-421和pGEX-PCV421-37表达蛋白免疫鼠血清的制备：分别大量诱导表达上述重组菌，将菌体用原培养液1/10体积的PBS重悬，超声波破碎至液体清澈，与5×SDS上样缓冲液煮沸变性5分钟，进行常规SDS-PAGE，电泳结束后，在考马斯亮蓝染液中染色2小时，再经脱色至背景清晰，用去离子水尽量洗去胶上的脱色液，再置胶于一干净玻片上，用干净刀片切下目的条带，放在1.5ml EP管中，尽量少混杂无关蛋白，-20℃冻存，免疫前，在冷冻状态下尽量碾碎胶条，用适量PBS重悬，至胶粒可通过10号注射器针头为宜，即为制备好的免疫原；选择健康活泼的青年雌性BALB/c小鼠，分别腹腔注射上述制备的免疫物质，每只每次0.5ml，每次免疫间隔2-3周，各免疫5只小鼠，2免后每次免疫前框下窦采血约100μl，析血清，对PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)，观察有无特异性荧光染色；1.7pGEX-PCV42-37表达蛋白与PCV感染猪多抗血清的ELISA反应性：将pGEX-PCV421-37和pPRO-Rep重组菌大量诱导表达后，同上制备免疫原，按常规方法进行ELISA，用碳酸盐缓冲液pH＝9.6分别以1∶40、1∶80、1∶160、1∶200稀释后包被酶标板，每个稀释度3个重复孔，4℃过夜，弃去孔内的液体，同时用洗涤液PBST洗3次，每次5分钟，拍干，每孔加100μl封闭液37℃封闭2小时，同上洗涤，将PCV2阳性猪血清和分别用PBS按1∶250、1∶500、1∶750、1∶1000、1∶1500稀释，各稀释度重复3次，每孔加50μl，同时设SPF猪阴性血清对照和PBS空白对照，37℃作用2小时，洗涤，拍干，加用PBS配制的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，每孔50μl，37℃孵育1.5小时，洗涤，拍干，加底物液，每孔加新鲜配制的底物缓冲液50-100μl与9mg邻苯二胺混合后，临时加30％H2O20.15ml，37℃静止10-30分钟，避光显色，当阴性孔即将显色时，以50μl 2mol/LH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上492nm波长下读取OD值，结果判定：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则直接用肉眼观察结果；2)制备兔猪圆环病毒2型高免血清用猪圆环病毒2型抗原，采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗猪圆环病毒2型IgG；3)胶体金颗粒制备将氯化金配制成0.01％水溶液，取100ml煮沸2min后，边搅拌边加入1％柠檬酸三钠2ml，煮沸至溶液颜色变成酒红色后，继续煮沸至适宜浓度OD535＝0.9312，冷却后加入双蒸馏水恢复到原体积，置4℃保存；4)胶体金标记ORF2蛋白制备及纯化将待标记蛋白倍比稀释，分别取100μl加入1ml胶体金中，10min后加入10％NaCl 100μl，4℃静止1h。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，在此基础上加30％为最佳标记量，取一定量调配好的胶体金用0.2mol/L K2CO3调至pH＝9.0，按最佳标记量加入表达抗原，室温作用20min，加入Tris-HCl(pH 8.0，20mmol/L)配制的BSA，使终浓度为1％，4℃放置2h后使用。将金标抗原3000r/min离心30min，取上清，60000g离心60min，沉淀用0.02mol/L pH7.2含0.1％BSA的PBS溶解，恢复到原体积。再超离1次，沉淀用少许上述PBS溶解，使OD535nm＝1.5。0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用；5)试纸条的组成用喷膜机将胶体金标记蛋白复合物喷涂在胶体金结合垫上，将表达ORF2蛋白和兔抗猪圆环病毒2型IgG依次间隔4mm喷在硝酸纤维膜NCM上，分别作为检测带和质控带，将包被好的NCM放入含3％BSA的pH7.2，0.01M PBS中，过夜，封闭其余蛋白结合位点，倒掉封闭液，用pH7.2，0.01M PBS，洗2次，每次5min，37℃干燥1h备用，将硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等一次粘在PVC板上，即，将玻璃纤维连接在NCM上端，边缘并附着在NCM上；棉浆垫附着在玻璃纤维上，与NCM衔接；吸水滤纸板连接在NCM下端，边缘并附着在NCM上，将粘好的PVC材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即制成猪圆环病毒2型胶体金抗体快速检测试纸条，将试纸条密封于铝箔袋中，4℃保存；6)扩增核苷酸序列由于PCV737-421片段是通过PCR扩增得来，分析测序结果是重组DNA的最大读码框覆盖了整个序列，中间未出现无义突变，与亲本毒JXL株同源性达100％，因此核苷酸序列表示如下，起始密码子ATG以斜线表示：PCV737-421：BamHIGGATCCGATATGACGTATCTAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGATTAAGGTTGAATTCEcoRI。