[发明专利]一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雄性山羊的睾丸的曲细精管得到精原细胞，山羊雄性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的山羊雄性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。分离到的山羊雄性生殖干细胞的培养为MEF有饲养层培养或者无饲养层培养。分离到的山羊雄性生殖干细胞具有ES细胞特性和向神经细胞、心肌细胞和精子样细胞的分化潜能。

主权项

1、一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离细胞将从无菌采集的山羊睾丸中分离的曲细精管剪碎至碎块，用包含体积分数10％FBS的DMEM培养液重悬2～3次曲细精管碎块，静置之后得到下层曲细精管细胞团；然后用包含质量分数0.1％的Collagenase、10μg/ml DNase和质量分数0.1％透明质酸酶的混合液消化处理下层曲细精管细胞团2～3次，每次20～30分钟，用包含体积分数10％FBS的DMEM培养液重悬，分离得到精原细胞；2)雄性生殖干细胞的原代培养将得到的精原细胞以5×105个/mL的密度接种在经质量分数0.2％的明胶37℃包被30min的塑料培养皿，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液；所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以DMEM高糖培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数20％的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/L β-巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、5～10ng/ml的碱性成纤维生长因子、1000U/ml的白血病抑制因子、100IU/ml青霉素和100mg/mL链霉素；培养12h后将未贴壁的细胞转到经Matrigel基质膜4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液；未贴壁的细胞第一次转移培养2h后，将转移培养后再次未贴壁的细胞转移培养到经Matrigel基质膜4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液；未贴壁细胞第二次转移培养后，2天更换一次培养液；细胞生长3～7天后，开始出现致密胚胎干细胞样集落；3)雄性生殖干细胞的传代培养待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时，将致密胚胎干细胞样集落吸出，在PBS中洗涤2次；再移到TrypLE细胞消化液或质量分数0.05％的胰蛋白酶中消化2～3min，并吹吸5～20次；将离散开的单细胞或小细胞团转移到经Matrigel基质膜4℃包被1小时的塑料培养皿培养，培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液；37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养；培养3～7天后，开始出现致密胚胎干细胞样集落，即为山羊雄性生殖干细胞。