[发明专利]一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺无效
申请号: | 200910023900.7 | 申请日: | 2009-09-14 |
公开(公告)号: | CN101709315A | 公开(公告)日: | 2010-05-19 |
发明(设计)人: | 龚国利;齐香君 | 申请(专利权)人: | 陕西科技大学 |
主分类号: | C12P19/40 | 分类号: | C12P19/40;C12R1/865 |
代理公司: | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人: | 陆万寿 |
地址: | 710021 陕西*** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | 本发明公开了一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺方法,即提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸发酵产量的方法。该方法包括:对酿酒酵母的Genome shuffling改造方法;适合S-腺苷甲硫氨酸产生的蔗糖、玉米蛋白粉等的选定以及3)发酵过程中甲硫氨酸脉冲添加等步骤,从而使得S-腺苷甲硫氨酸的微生物发酵生产产量达到27g/L的水平。 | ||
搜索关键词: | 一种 提高 腺苷 甲硫氨酸 产量 发酵 工艺 | ||
【主权项】:
一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:(1)发酵菌株的选择:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857,ATCC60593,ATCC66103和ATCC76625菌株之一;(2)发酵菌株的Genome shuffling改造:将上述菌株分别接种到固体斜面培养基上,pH 6.2-6.8;30-35℃,培养18-24小时后,接种液体培养基,pH6.2-6.8;30-35℃,120-180rpm摇床培养18-24小时,获得4个菌株的液体培养物;以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞,分别装在4个50ml无菌离心管中,然后向每个离心管中都加入10ml ST溶液,pH7.4,震荡5分钟,离心弃上清;然后加入蜗牛酶混合液,pH7.4,恒温震荡水浴37℃60-100rpm,震荡20-30分钟,离心弃上清,获得原生质体;原生质体用10ml ST溶液洗涤三次;然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中,加入30ml PTC溶液,pH7.5,恒温震荡水浴35-37℃ 60-80rpm震荡30-40分钟,进行原生质体融合,融合结束后,离心弃上清得沉淀为融合原生质体,用ST溶液洗涤三次;最后在离心管中加入40ml ST溶液制成菌悬液,菌悬液涂布固体再生培养基,pH5.5-6.2;30℃,培养48小时,用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体,再进行原生质体融合,融合原生质体涂布再生平板;以上重复3-5轮;最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量;SAM产量为10-12g/L的改造菌株;(3)发酵培养条件的优化:将获得改造菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养24小时后,接种液体发酵培养基,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,培养24小时;获得液体发酵液;(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响:将上述菌株接种固体斜面培养基,培养基成分同上,30℃,培养2天后,接种液体发酵培养基,30℃,120rpm摇床培养24小时;发酵过程中,脉冲补加DL-甲硫氨酸,发酵容器为300ml三角瓶,内装100ml培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120rpm,脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次,每次补加0.05-0.2g甲硫氨酸,12-24小时每隔10分钟补加一次,每次补加0.1-0.4g甲硫氨酸;培养结束后获得液体发酵液。(5)SAM的定量分析:将步骤3或4获得液体发酵液每个都取3ml,置于5ml离心管中,4000rpm,离心10min,去上清液,收集菌体,加入浓度为20%的高氯酸4.5mL,振荡30min后,12000rpm,离心10min,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤作为HPLC分析的样品,利用高效液相色谱仪获得HPLC谱图,在HPLC谱图上SAM保留时间处具有较大的峰面积代表SAM产量较高的改造菌株,HPLC分析条件为:色谱柱为AT LiCHROMC18反相柱;检测波长为260nm;流动相的制备方法为取4.7g甲酸铵,用750mL纯净水溶解后,与250mL甲醇混匀,加入1g辛烷磺酸钠,然后用乙酸调pH为4;流速为1ml/min;进样量为10μL;SAM的保留时间为12.3min;(6)SAM的提取纯化:将100ml发酵液3000-4000rpm,离心10-15min收集细胞;然后用20-30ml乙酸乙酯处理15min,再用25-35mL 0.35M硫酸处理15-20min;3000-4000rpm,离心10min;取上清液的下层水相慢慢滴入50-80ml无水甲醇溶液中,置于冰箱内4℃下放置18-24h;取出冷藏的溶液过滤,滤渣冷冻干燥即得纯化的SAM。
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