[发明专利]一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法

摘要

一种枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的发酵制备与提取的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明涉及利用枯草芽孢杆菌Zj016的发酵罐生产条件，收集发酵液，通过澄清、超滤浓缩和盐析，获得脱苦氨肽酶制品。选用的一株枯草芽孢杆菌Zj016，它生产的氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的氨基端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，制备的大豆多肽无苦味，且二肽、三肽等寡肽含量较高。此外，通过对该枯草芽孢杆菌所产酶系的研究发现，它只产外切型蛋白酶，不具备内切蛋白酶的活性，且此外切蛋白酶对末端疏水性强的氨基酸的水解能力较强，此研究更进一步说明它能够降低或消除大豆蛋白水解中产生的苦味。

主权项

1、一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的发酵制备与提取的方法，其特征是工艺为：A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：(1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；(2)种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2；(3)种子培养：分为一级种子培养和二级种子培养，一级和二级种子培养基相同；一级种子培养：取0.2mL保藏好的菌种接入250mL培养瓶中的50mL种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养8h；二级种子培养：取一级种子液接种到种子培养基中，转速200rpm，37℃，培养6h；(4)发酵培养基组成：玉米粉25～35g/L，豆渣粉6～12g/L，K2HPO42.7～3.8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～0.7g/L，浓度0.1mol/L的CoCl21～3mL/每L培养基，调节pH至7.5；(5)原料的预处理：液化处理：按发酵培养基的组成将发酵培养基的原料与一定量的水混匀，将温度升高到85℃，调pH至5.6，淀粉酶的用量40U/g培养基原料，不停地搅拌，水解2h；糖化处理：将经过液化处理后的培养基原料冷却至65℃，调pH至4.5，糖化酶的用量500U/g培养基原料，不停地搅拌，水解1.5h；(6)发酵罐发酵条件：7L发酵罐装液量4L，接种量以体积计为4％，起始pH 7.0-8.0，培养温度35-40℃，转速400～1000rpm，通气量为2∶1v/v·min，溶氧DO与转速相协调，控制DO≥60％，培养15h；发酵过程中的补料操作：补料的溶液为200g葡萄糖/L，补料体积为200mL，补料的方式选用一次性补料或两次补料，补料的时机根据发酵过程中的还原糖的浓度变化来确定，保持发酵液中还原糖浓度不低于2g/L；(7)收集发酵液：将发酵液4℃、10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；B氨肽酶的提取：(8)在4℃下向收集的上清液中加入(NH4)2SO4，质量分数为15％，4℃、10000rpm离心10min，弃沉淀，收集澄清液；(9)将收集到的澄清液选用截留相对分子质量为30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩3-5倍；(10)向浓缩液中继续添加(NH4)2SO4，添加的(NH4)2SO4质量为浓缩液质量分数的25％，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，取沉淀；(11)将沉淀冷冻干燥，即得到固体的氨肽酶。