[发明专利]一种重组酵母脂肪酶的发酵制备方法

摘要

一种重组酵母脂肪酶的发酵制备方法，属于酶的基因工程技术领域。本发明将含有华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶编码基因SEQ IDNO：1的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL种子培养，然后按5％～10％接种量接种于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM₁溶液的基础盐培养基BSM中；通气搅拌培养，流加补料生长培养液，流加诱导培养液，收集发酵液，加入终浓度均为3％～6％的氯化钙和磷酸氢二钠作为酵母菌体絮凝剂，板框过滤，超滤浓缩，最终制备得到浓缩5～10倍的液体脂肪酶制品；重组酵母发酵培养过程中脂肪酶的表达量可达到2000U/mL发酵液，蛋白表达量为2.5g/L，发酵液比活800U/mg。

主权项

1、一种发酵制备脂肪酶的方法，其特征是步骤为：将含有华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶编码基因SEQ IDNO：1的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL种子培养，然后按5％～10％接种量接种于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM1溶液的基础盐培养基BSM中；通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度控制在20％～60％；流加补料生长培养液：菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加质量浓度25％的工业氨水控制pH5～7，当发酵培养基中的底物甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加含12mL/L的PTM1的500g/L的甘油补料生长培养液；温度控制在28℃；流加诱导培养液：当细胞光密度OD600达到60～120后，流加补料生长培养液，维持饥饿状态约30min，彻底耗尽甘油，然后补入甲醇诱导培养液，体系中甲醇浓度控制在质量百分0.05％～3％，继续培养2～5天，温度控制在20～28℃；收集发酵液，加入终浓度均为3％～6％的氯化钙和磷酸氢二钠作为酵母菌体絮凝剂，板框过滤，超滤浓缩，制备得到浓缩5～10倍的液体脂肪酶制品；所述培养基为：(1)种子培养基BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，甘油20g/L，500×生物素2mL/L，pH6.0磷酸缓冲液100mL/L；用500mL的三角瓶培养，装液量10％；(2)微量元素PTM1溶液：CuS04·5H206g/L，KI0.08g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H200.2g/L，H3BO30.02g/L，ZnSO4·7H2O20g/L，FeSO4·7H2065g/L，CoCl2·6H200.5g/L，生物素0.2g/L，H2SO45mL/L；(3)基础盐培养基BSM：85％H3PO426.7mL/L，CaSO40.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2014.9g/L，KOH4.13g/L；(4)发酵培养基：用基础盐培养基BSM配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM1溶液；(5)补料生长培养液含12mL/L的PTM1的500g/L甘油补料液；(6)诱导培养液含12mL/L的PTM1的100％甲醇诱导液。