[发明专利]一种苏丹红Ⅱ完全抗原的合成方法

摘要

一种苏丹红II完全抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以苏丹红II为原料，在吡啶条件下与琥珀酸酐发生缩合反应，生成苏丹红II-半琥珀酸酯；利用活化酯法使苏丹红II-半琥珀酸酯上的羧基与牛血清蛋白BSA结合，制备苏丹红II完全抗原。用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了苏丹红II的完全抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对苏丹红II研究的需要。

主权项

1.一种苏丹红II完全抗原的合成方法，其特征是第一步为半抗原的制备，以苏丹红II为原料，在吡啶条件下与琥珀酸酐发生缩合反应，生成苏丹红II-半琥珀酸酯；第二步为完全抗原的制备及检测，利用活化酯法使苏丹红II-半琥珀酸酯上的羧基与牛血清蛋白结合，制备苏丹红II完全抗原；工艺步骤为：(1)苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原的合成：称取苏丹红II于50mL的圆底烧瓶中，加入吡啶，搅拌溶解，加入琥珀酸酐，苏丹红II与琥珀酸酐等摩尔投料，在90℃条件下搅拌反应24h，反应完成后，旋转蒸发除去吡啶，将反应液预先冷却至4℃，然后移入含有质量浓度10％盐酸的冰蒸馏水中静置过夜，沉淀以蒸馏水洗至pH6.0，真空干燥，得苏丹红II-半琥珀酸酯人工半抗原粗制品；(2)苏丹红II完全抗原的合成：制备A液：称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解后，加入0.1mmol的N，N′-二环己基碳酰亚胺，0.1mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌反应60min，4℃保存，此液为A液；制备B液：称取150mg的牛血清蛋白溶于2mL的0.01mol/L的碳酸氢钠缓冲液中，4℃保存，此液为B液；在4℃搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并边加边摇，于4℃下孵育3h，即得苏丹红II完全抗原混合液；透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；透析：将苏丹红II完全抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01mol/L的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到苏丹红II完全抗原：苏丹红II-半琥珀酸酯-牛血清蛋白；(3)苏丹红II完全抗原的鉴定：苏丹红II完全抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用牛血清蛋白标准液得到标准曲线，从曲线上比对得到抗原溶液的蛋白浓度，计算摩尔吸光系数ε，再测定苏丹红II完全抗原的偶联比。