[发明专利]一种基于酵母表面展示的分选酶检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，包括下列步骤：A.将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；B.构建QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建；C.表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母；D.酵母表面蛋白的表达：将阳性转化子分别经过YPD和BGMY液体培养基转接培养，然后在BMMY液体培养基中诱导表达；E.酵母表面蛋白的检测；F.分选酶的表达；G.分选酶活性检。本发明利用酵母表面展示技术，然后用荧光分光光度计和流式细胞仪检测，所用到的物质价格比较低，大大降低了分选酶活性测定的成本，且操作简便。

主权项

1、一种基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，其特征在于包括下列步骤：A、根据金黄色葡萄球菌分选酶的能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作为模板，引物为5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAGAAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，划线部分为底物QALPETGEE基因，将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；B、QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建：分别对表达载体pKFS和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP进行双酶切，构建表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP；C、表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母；D、酵母表面蛋白的表达：将阳性转化子分别经过YPD和BGMY液体培养基转接培养，然后在BMMY液体培养基中诱导表达；E、酵母表面蛋白的检测：离心收集菌体，PBS反复洗涤菌体，弃上清，重新悬浮于PBS中；分别用荧光显微镜进行定性观察，用流式细胞仪eGFP进行定量；F、分选酶的表达：从金黄色葡萄球菌基因组中克隆分选酶基因，将分选酶的基因引入pTRX载体中，然后在大肠杆菌BL21中表达pTRX-srtA，通过双酶切、测序鉴定阳性转化子，并在LB液体培养基中用IPTG诱导表达分选酶蛋白；G、分选酶活性检：离心沉淀大肠杆菌BL21，经过TE buffer洗涤菌体、裂解buffer重悬、超声波破碎即得分选酶上清液；培养酵母菌体，离心，用PBS反复洗涤，备用；加入分选酶及在表面展示的分选酶底物反应，通过流式细胞仪和荧光分光光度计检测。