[发明专利]丹参EST-SSR分子标记的制备方法、特异引物及其应用

摘要

本发明公开了一种丹参EST-SSR分子标记的制备方法，主要包括：丹参EST序列的获得及预处理、丹参EST序列中SSR位点的筛选、丹参EST-SSR引物的设计与合成、丹参EST-SSR引物的筛选等步骤。该方法针对丹参EST进行SSR位点挖掘，依据SSR位点侧翼序列进行PCR引物设计，并在此基础上构建丹参种属特异性EST-SSR标记体系；为丹参及鼠尾草属近缘物种的遗传多样性评价、亲缘关系或种质鉴定、遗传连锁作图、分子标记辅助选择、基因定位克隆、功能基因组分析以及相关研究等奠定基础。本发明还公开了依据上述丹参EST-SSR分子标记制备方法得到的EST-SSR位点特异引物及其应用。

主权项

1、丹参EST-SSR分子标记的制备方法，包括下述主要步骤：(1)、丹参EST序列的获得及预处理：从GenBank中下载丹参EST序列；去除载体污染和重复序列，去除5’端或3’端的polyT或polyA，进行EST重叠群分析和聚类、去除冗余EST序列，并去除长度小于100bp的EST序列，拼接后得到非冗余Uni-EST序列；(2)、丹参EST序列中SSR位点的筛选：采用SSR位点检索专用软件，在上述步骤(1)得到的非冗余Uni-EST序列中检索SSR位点，检索的限制条件包括：不同重复基元的SSR其总重复序列长度≥20bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸至少重复次数分别为10次、7次、5次、4次、4次；中间被≤5bp的间隔碱基打断的不完全重复SSR计为一个SSR位点；检索得到一系列EST-SSR位点。(3)、丹参EST-SSR引物的设计与合成：依据上述步骤(2)得到的EST-SSR位点的侧翼区域序列，进行引物设计，引物设计主要参数包括：GC含量40％-60％，Tm值45℃-65℃，引物长度18bp-23bp，预期扩增产物长度120bp-350bp；得到的引物序列经Blastn比对，根据结果重点对引物的3’端碱基及正反向引物间隔进行调整，得到一系列EST-SSR位点扩增特异引物；引物设计完成后进行合成；(4)、丹参EST-SSR引物的筛选：采用上述步骤(3)合成的引物，以丹参或者其它鼠尾草属近缘物种样品的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，根据扩增结果，筛选得到可有效扩增的丹参EST-SSR引物。