[发明专利]建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的方法

摘要

本发明提供一种为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件的建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的方法。实验方法步骤如下：奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定；HPLC法测定乳糖的分泌情况；HPLC法测定β-酪蛋白的分泌情况；细胞的冻存和复苏。本发明采用组织块法对不同时期的奶牛乳腺上皮细胞进行培养，与酶消化等其他乳腺上皮细胞原代培养的方法相比，其不影响乳腺上皮细胞的活性，且培养成本十分低廉，操作十分简便。本发明实现了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系的延续，从而使大量珍贵的奶牛乳腺组织材料获得了妥善有效的保存。本发明为奶牛乳腺不同发育时期泌乳机理的研究提供了重要的实验材料和技术平台。

主权项

1.一种建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的方法，其特征在于：实验方法步骤如下：步骤一：奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定乳房中部消毒，按照常规手术切取少量乳腺组织块，立即用D-Hanks液清洗组织块并尽量剥离脂肪组织和结缔组织，取乳腺腺泡组织部分剪成1mm3的小块，以0.5cm的间距接种于预铺胶原蛋白的细胞培养瓶中，铺满整瓶后，倒置培养于37℃的CO2培养箱中3～4h，至组织块牢固贴于胶原上时，轻轻将生长培养液加入培养瓶中，以覆盖组织块为准，随后置于培养箱中继续培养，每隔2d更换一次培养液，至细胞生长密度达80％～90％时，利用乳腺上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同对细胞进行传代培养以获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞；采用常规的细胞免疫荧光染色方法对乳腺上皮细胞特异性的角蛋白18抗体进行荧光染色进行激光共聚焦观察以对乳腺上皮细胞进行鉴定；步骤二：HPLC法测定乳糖的分泌情况检测样品的处理：用流动相溶解不同浓度的乳糖标准样品，用纯水重悬不同处理组细胞，置于冰上用匀浆器机械破碎细胞，0.22μm滤膜过滤裂解液后用于乳糖的HPLC检测；HPLC的检测条件：色谱柱，十八烷基硅烷键合硅胶，Φ4.6×150mm；柱温，室温；紫外检测波长，195nm；流动相，5％乙睛，经过0.22μm滤膜过滤，超声脱气；流速，恒流0.6ml/min；进样体积，10μl；分别以浓度为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的乳糖标准品进行HPLC，以乳糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作乳糖标准曲线；细胞样品与乳糖标准品采用完全相同的HPLC检测条件；步骤三：HPLC法测定β-酪蛋白的分泌情况检测样品的处理：用流动相溶解不同浓度的β-酪蛋白标准样品，用纯水重悬不同处理组细胞，置于冰上用匀浆器机械破碎细胞，0.22μm滤膜过滤裂解液后用于β-酪蛋白的HPLC检测；HPLC的检测条件：TSK凝胶柱，Φ7.8×300mm；柱温，室温；紫外检测波长，280nm；流动相，超纯水，经过0.22μm滤膜过滤，超声脱气；流速，恒流0.6ml/min；进样体积，10μl；分别以浓度为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的β-酪蛋白标准品进行HPLC，以乳糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作β-酪蛋白标准曲线；细胞样品与β-酪蛋白标准品采用完全相同的HPLC检测条件；步骤四：细胞的冻存和复苏以20％DF12培养液、15％DMSO、HEPES和丙酮酸钠作为冻存缓冲保护液，与FBS以1∶1的比例对乳腺上皮细胞进行冻存；具体操作方法为：弃去培养液，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化乳腺上皮细胞，加培养液终止消化，制成细胞悬液，收集到离心管中，1000r/min离心得细胞沉淀；用37℃预热的FBS重悬细胞，以适量密度分装于冻存管中，然后向每个冻存管中逐滴加入4℃预冷的冻存缓冲液，轻轻混匀；将写有奶牛乳腺上皮细胞名称、冻存日期及培养液类型的标签贴于冻存管上；将冻存管封闭于保温盒中置-80℃冰箱中，使细胞缓慢冻存，12-24h后将细胞投入液氮罐中长期保存；细胞的复苏采用如下方法：取出保存细胞的冻存管，放入37℃～40℃水浴中之完全融化，一旦冰块消失马上将其取出；用75％乙醇擦洗冻存管外部以降低污染机会；吸出冻存管内容物于离心管中，缓慢加入新鲜培养液并轻轻混匀以清洗细胞；1000r/min，离心5min，得细胞沉淀，按照冻存前的细胞密度将细胞沉淀用新鲜培养液重悬接种。