[发明专利]固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法

摘要

本发明涉及一种毛细管电泳用于微生物等电点的测定方法，属于生物分析领域。本发明首先将载体两性电解质溶液在毛细管内采用恒定电压进行等电聚焦，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质；其次将样品溶液注入毛细管中，采用恒定电压等电聚焦；然后采用固定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口，可确定样品聚焦点的位置；最后根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值。本方法可用于多种微生物同时在线检测，对于微生物等电点检测具有普适性。

主权项

1、固定化pH梯度的毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法，其特征在于具体测量步骤如下：1)首先对毛细管进行预处理，依次用0.1M HCl冲洗10min以上、水冲洗5min以上、1MNaOH冲洗20min以上、0.1MNaOH冲洗20min以上、水冲洗20min以上及甲醇冲洗20min以上，氮气吹干后备用；将异氰酸酯加入无水吡啶溶液后注入毛细管中，在65～75℃反应12小时以上，使异氰酸酯键合于毛细管内壁；再依次用甲苯，甲醇，三蒸水，20mM pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗毛细管内壁，各冲洗10min以上；2)将载体两性电解质溶液(Ampholine)以1％～5％体积比溶于20mM磷酸盐缓冲液中，将混合溶液注入毛细管；将靠近检测窗口的一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液，然后加10～25KV的恒定电压进行等电聚焦，待电流稳定后聚焦完成，将毛细管两端插入去离子水中，静置反应12小时以上，使毛细管内壁上形成连续pH梯度的两性电解质；其中阴极缓冲液15～20mM的NaOH溶液，阳极缓冲液为15～20mM的H3PO4溶液；3)将上步制得的毛细管用pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗1h以上；将样品微生物加入pH7.0的磷酸盐缓冲液中制备成浓度为104～105cfu/ml样品溶液，将样品溶液注入毛细管中，采用10～25KV的恒定电压等电聚焦；待电流平稳后，聚焦完成，停止加电压；用固定气压，将毛细管内样品从聚焦段匀速推动经过检查窗口，记录对样品开始加压到经过检测窗口的时间；4)再次注入样品，求出采用步骤3)中的固定气压使样品从毛细管注入端流经检测窗口的时间，由于毛细管长度已知，从而得到该固定气压下样品溶液在毛细管内的匀速迁移速度，再很据步骤3)得到的样品开始加压到经过检测窗口的时间，求出该固定气压下样品从聚焦点到经过检测窗口的距离，即可求得聚焦点到进口端的距离L差；5)根据pH梯度与毛细管长的线性关系，求出聚焦点的pH值的表示公式：pH求＝pH始+pH差(L差/L总)其中“pH始”表示选用载体两性电解质溶液的pH最小值，“pH差”表示选用载体两性电解质溶液的pH范围差；“L差”表示聚焦点到进口端的距离；“L总”表示毛细管的总长度；6)将步骤4)求得的“L差”代入线性方程即可求出样品在聚焦点出的pH值。