[发明专利]一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法

摘要

本发明涉及一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法，属生物技术领域。本发明的繁殖泛生墙藓原丝体的具体步骤为：a.成熟孢子的灭菌，以含1.0的氯化汞和1.0％洗涤剂的溶液对孢蒴表面消毒0.5-1分钟；b.固体培养基上的萌发：取孢子接种到添加了2，4-D 2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中25±3℃培养10-20天，光照度为4000lx；c.原丝体的大量繁殖是经添加2，4-D 2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS孢子萌发液体培养基中在25±3℃下，120rpm摇床培养7-10天，光源为漫射光后得到，也能用发酵罐通无菌空气200L/小时扩大培养，少量原丝体用800rpm离心收集，大量原丝体用4-8层纱布过滤收集。本发明具有制备方法简便、成本低、得到的原丝体发育程度一致的优点。

主权项

1、一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法，其特征在于繁殖泛生墙藓原丝体的具体步骤如下：a. 成熟孢子的灭菌：挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1—2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5-1分钟；而后用含1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在40℃的水浴中刺激40-50秒；b. 固体培养基上的萌发：在无菌条件下，取密度为104-106/ml的孢子，接种到添加了2，4-二氯苯氧基乙酸2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中，培养温度为25℃±3℃，光照度为40001 x，10-20天后获得由孢子萌发的初生原丝体；c. 原丝体的大量繁殖及收集：用镊子夹取体积为10-1000mm3萌发的原丝体，接种到添加了2，4-D2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2，120rpm摇床培养7-10天，环境温度控制在25±3℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15天后获得大量原丝体；如需要更大量的原丝体，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同培养液倒入玻璃发酵罐中，加入3—10倍体积的新鲜培养液，底部按200L/小时通入无菌空气，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准，培养7—15天后停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大培养，如此反复至罐体最大容积为止，即获得更大量的原丝体；收集原丝体时，将三角瓶中培养的原丝体全部混悬液倒入离心管中，用800rpm/min离心2分钟，弃去上清液后得到原丝体；发酵罐中的大量原丝体用4—8层纱布过滤收集获得。