[发明专利]从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法

摘要

本发明是一种利用异硫氰酸胍-氯仿抽提、Tris饱和酚纯化植物RNA的抽提方法。本发明改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第二步用Tris饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。本发明操作步骤简单、经济实惠、稳定性好，适用于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取高质量总RNA。

主权项

1、一种从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)称取1-2克植物组织，在预冷的研钵中用液氮研磨成粉，转入50mL离心管中，迅速加入10-20mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀后置于冰上5分钟，再加入pH4.5-5.5的3mol L-1醋酸钠1-2mL，上下颠倒混匀；RNA抽提缓冲液组成成分为4mol L-1异硫氰酸胍，25mmol L-1柠檬酸钠，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，2％(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每100mL抽提缓冲液加入0.5mL β-巯基乙醇；(2)加入11-22mL的氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10分钟后于4℃12000g离心10分钟，取上清液置于新的离心管中；(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；(4)在上清液中加入10-20mL异丙醇，混匀后置于-20℃30分钟，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；(5)用75％的乙醇溶液清洗沉淀2次，置于室温干燥20分钟，用DEPC处理过的ddH2O1-2mL彻底溶解RNA沉淀(6)在RNA溶液中加入Tris饱和酚1-2mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10分钟，取上清液；(7)在上清液中加入1-2mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10分钟，取上清液；(8)在上清液中加入pH4.5-5.5的3mol L-1醋酸钠0.1-0.2mL和1-2mL异丙醇，混匀后于-20℃中放置30分钟，4℃12000g离心15分钟得到RNA沉淀；(9)用75％乙醇溶液洗RNA沉淀物2次，室温干燥20分钟后，用100-200μL DEPC处理过的ddH2O溶解沉淀，获得纯化后的RNA；