[发明专利]番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法

摘要

本发明公开了番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，属于蔬菜抗病育种技术领域。该方法按以下步骤进行：(1)从育种分离世代材料提取DNA；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记；(3)DNA的双重PCR扩增与电泳分析检测；(4)依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。本发明可在实验室对育种进程中的任何世代材料，对其是否聚合抗TYLCV的基因进行准确、快速的检测，从而明显缩短了抗病育种的周期，缩小了育种规模，并具有操作简便、省时、省力、省成本等优点，减少了工作量，提高了对抗性材料的筛选效率，加快了抗病育种进程。该发明可在番茄育种单位推广应用。

主权项

1、番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：(1)从育种分离世代材料提取DNA：将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长至3～4片真叶时，每植株取1片幼叶，用改进的CTAB法提取DNA；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记：根据已发表的文献资料，初选出抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记，合成引物后进行PCR扩增；并根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果，从中筛选出适合自己育种材料的抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-2和Ty-3的SCAR分子标记；Ty-2上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，Ty-3上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；(3)双重PCR反应体系的建立与电泳分析检测：Ty-2和Ty-3基因的双重PCR反应体系为：扩增反应的总体积为10微升，0.7μL DNA模板，0.2μL 10mmol·L-1dNTPs，50ng·μL-1的Ty-2上、下游引物各0.125μL，50ng·μL-1的Ty-3上、下游引物各0.125μL，1μL含20mmol·L-1Mg2+的10×反应缓冲液，2U·μL-1的Taq酶0.25μL，无菌纯水7.35μL；PCR反应程序为：94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，54℃复性1min，72℃延伸1min，40个扩增循环，最后72℃延伸10min；PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析、EB染色，在Bio-RAD凝胶成像系统上自动成像；(4)依据检测结果对育种分离世代材料抗性的评价：依据成像对育种分离世代材料抗性进行评价，若扩增条带中含有900bp和/或450bp大小的DNA条带，则该材料中含有抗番茄黄化曲叶病毒病的Ty-2和/或Ty-3基因；若反之，则该材料中没有Ty-2和/或Ty-3基因。