[发明专利]5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法及使用方法

摘要

本发明公开的5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，步骤如下：用LB培养基平板活化保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA；将平板上的单克隆接种于LB培养基摇瓶中培养，将得到的种子接种于LB培养基的摇瓶中发酵培养，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷降温诱导，收获菌体；菌体经离心和超声破胞，分离获得重组的ALA合成酶和ALA脱水酶；使用不同糖类物质作为添加剂，筛选对ALA脱水酶具备抑制作用，同时对ALA合成酶没有抑制作用的糖类抑制剂木糖。本发明的ALA脱水酶抑制剂属于生物质资源，对环境友好，用于发酵生产ALA，可使产量明显提高。

主权项

1.5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其步骤为：1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃培养7-10h得到种子；3)取2ml-4ml种子接种于含100-150ml LB培养基的500ml的摇瓶中，起始培养温度为37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；4)诱导培养4-8h，在菌体密度OD600达到3-5时，收获菌体；5)菌体经离心和超声破胞后获得粗酶液，亲和层析分离粗酶液获得重组的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液经凝胶过滤层析获得5-氨基乙酰丙酸脱水酶；6)将糖类物质添加到5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类物质的5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比较酶的活力，筛选对5-氨基乙酰丙酸合成酶的活力没有抑制作用的糖类；再将筛选得到的糖类添加到5-氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液比较酶的活力，筛选具有抑制5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力作用的糖类，即为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。