[发明专利]棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法

摘要

本发明公开了棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法，属于生物基因工程技术领域。该方法针对棉粕及其发酵产物中所含蛋白类、多糖类和酚类物质，在对微生物总DNA提取过程中及其后续分子操作中产生的不利影响，提出以脱色除酚类和反复抽提除蛋白质、多糖类物质，及微生物细胞温和破壁等关键技术组成的高质量提取微生物总DNA的方法。具有针对性强，简单易行，提取成本较低等特点，所获DNA可直接用于PCR扩增和酶切反应，为用分子生态学方法研究微生物发酵棉粕脱毒奠定了基础。本发明可用于有关棉粕综合开发技术研究单位或领域。

主权项

1、棉粕发酵样品微生物总DNA的提取方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)称取棉粕发酵样品0.5-2g置于灭菌的10mL eppendoff管中，加入3-5mL-1棉粕脱色缓冲液，在涡旋混合器上混合2-3min，37-45℃水浴10min，再涡旋混合2-3min，6000-9000×g离心10-15min，用移液枪吸去上清液；重复上述步骤2-5次直至上层液体颜色由褐色转为淡黄色；(2)在步骤(1)的沉淀物中加入1-3mL棉粕发酵样品微生物DNA提取缓冲液，再加入溶菌酶使其在提取混合物中的浓度为2-4mg·mL-1，混匀后37℃水浴1.5-2h；随后加入十六烷基三甲基溴化胺使其在提取混合物中的浓度为1％-2％，混匀后加入蛋白酶K，使其在提取混合物中的浓度为0.2-0.4mg·mL-1，混匀后55℃水浴1-2h；水浴后在提取混合物中加入5mol·L-1的NaCl溶液使其在提取混合物中的浓度为0.7-0.9mol·L-1；(3)在提取混合物中按体积比加入15％65℃预热的CTAB-NaCl溶液，混匀后65℃水浴20-30min；在混合物中再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中；重复上述步骤2-3次，至离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；(4)在装有上清液的eppendoff管中按体积比加入β-巯基乙醇使其浓度为2％；混匀后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中；在该管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后10000-14000×g离心10-15min，将上清液移入新的eppendoff管中，重复上述步骤2-3次，使离心后eppendoff管中液相和有机相之间没有沉淀物；(5)在步骤(4)上清液中加入0.6-0.8倍体积的4℃预冷的异丙醇，混匀后在4℃下放置0.5-1h，以10000-14000×g离心15-20min，弃去上清液；用70％的乙醇洗涤沉淀物2-3次后，用无菌风吹干，加入50-100μL含有1μg·mL-1RNase的TE缓冲液溶解DNA，37℃水浴20-30min后移入1.5mLeppendoff管中，-20℃保存。