[发明专利]青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法

摘要

本发明公开了青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：(1)培养基的配制；(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：1)供体植株与花蕾的选择；2)花蕾灭菌；3)花蕾预处理培养；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装；5)小孢子胚状体的培养；6)再生植株的分化培养；7)再生植株的生根与移栽及8)再生植株的倍性检测。本发明显著提高了青花菜小孢子培养的出胚率、出苗率与再生植株的二倍体率，由常规的80个胚/蕾、50％与50％左右，分别提高为120个胚/蕾、70％及70％以上，从而可提高青花菜的育种效率。该方法可在蔬菜育种单位或企业中推广应用。

主权项

1、青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含的重量为：1)花蕾预处理培养基：B5液体培养基+0.05-0.2％秋水仙碱+1-3％DMSO，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；2)胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基，其中蔗糖或白糖130g/L，pH5.6-6.0，过滤灭菌；3)胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.05-0.2mg/L+BAP 0.5-2.0mg/L+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂6-10g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；4)生根培养基：MS培养基+蔗糖或白糖20-30g/L，琼脂8-12g/L，pH5.6-6.0，高温灭菌；(2)青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：1)供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的青花菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；2)花蕾灭菌：用5.2％活性氯次氯酸钠50mL/L+95％酒精100mL/L+吐温20100μL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟，再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3)花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于4mL花蕾预处理培养基上，在4℃下培养2-4d；4)花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅拌成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按850-1000rpm离心3-5分钟，弃上清液后再加10mL胚状体诱导培养基继续按同法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1个花蕾后，再按每4mL培养基中加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖2-5g/L+1g/L活性炭配制、灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为6mm或9mm、塑料或玻璃的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；5)小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-72小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养1-2周至肉眼可见细胞团出现；再在25℃黑暗下45rpm振荡培养1-2周，至子叶型胚状体形成并成熟；6)再生植株的分化培养：将培养皿置超净台上从中选取子叶型成熟胚状体，将其胚根插入胚状体分化培养基中，在每天光照16小时、25℃下培养1-3周至形成愈伤组织；再按大小将愈伤组织切成3-5块放置相同培养基与条件下培养，直至分化、长出再生植株；7)再生植株的生根与移栽培养：切取正常的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；3周后将生根再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2∶1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；8)再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partec PA倍性分析仪检测各再生植株的DNA倍性，并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本用于育种。