[发明专利]雪莲原生质体的分离和培养方法

摘要

本发明涉及新疆雪莲原生质体的分离和培养方法，该方法由无菌雪莲苗的培养、胚性愈伤组织的诱导及分化、原生质的分离与纯化和原生质体培养四个步骤完成，均适用于新疆雪莲的原生质体的分离和培养。同时本发明具有方法简单易于操作，对设备和培养条件的要求较低；此外，酶解的方法实用，去除细胞壁条件温和，分离原生质体的得率高、活性强易于雪莲原生质体的培养和植株再生，为原生质体培养和融合奠定了基础，也为新疆雪莲种质资源创新和转基因雪莲的研究奠定了基础。

主权项

1、一种雪莲原生质体的分离和培养方法，其特征在于按下列步骤进行：a、筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2-3小时进行表面清洗，然后在超净工作台上用75％酒精浸泡10-60s，0.1％的升汞灭菌1-10min，15％的过氧化氢处理20-40min，无菌水冲洗3-4次，然后用无菌水浸泡10min；b、将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基，温度23±1℃，光照2500-3000lx，时间16h/d，10-20d开始萌发；c、将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成1-2cm的片段，接入培养基MS+NAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+2，4-D 0.1-0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间16h/d，进行胚性愈伤组织的诱导和分化；d、将步骤c胚性愈伤组织继代1-3次，称取1g胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13％甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25℃黑暗条件下，处理3-5小时；e、将步骤d的质壁分离液慢慢地倒出，将胚性愈伤组织置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26±2℃，黑暗条件下进行酶解，酶解时间12-16h；f、将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化的雪莲组织碎片，然后将滤液在1000rpm条件下离心5min，弃上清液，加入3-4ml的CPW+10％甘露醇溶液进行原生质体清洗，然后置于转速1000rpm条件下离心2-5min，弃上清液，保留1ml洗液，用移液枪将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20％蔗糖溶液上，在转速800rpm条件下离心5-10min，再用200μl移液枪轻轻将原生质体吸出，加入2-5ml的CPW+10％甘露醇溶液进行原生质体再次清洗，在转速1000rpm离心2-5min，弃上清液；g、将步骤f分离纯化后的雪莲原生质体100μl放于1ml的离心管用于镜检，用血球计数板来调整原生质体的培养密度为1×105个/ml；h、将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26±2℃，黑暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，经过1-2月后在原生质体培养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基为NT或DPD中附加激素NAA1.0-1.5mg/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+2，4-D 0.1-0.5mg/L。