[发明专利]一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法

摘要

一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，属于食品微生物的检测方法。包括以下工艺步骤：1)牛乳嗜冷菌的筛选；2)提取牛乳嗜冷菌的基因组；3)PCR扩增；4)扩增产物进行电泳检测；5)结果判断。本发明不仅有助于为生产健康、安全、营养的乳制品提供一定的技术支持与工艺参考，而且也有助于乳业的健康发展与长足进步，使现代生物技术促对传统嗜冷菌的鉴定方法手段和方法得到快速发展。采用本发明的检测方法缩短了检测周期，由原来的10多天缩短到1天，甚至不到1天；运用了分子生物学法提高了检测的灵敏度和精确度，检测精度达到100％。

主权项

一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1)牛乳嗜冷菌的筛选用接种环无菌操作从原料乳中取样，在特异筛选培养基制成的平板上进行划线分离，在温度30-37℃下培养15-25小时后，平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定菌株，所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1-3g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖0.5-1.5g/L、甲基紫0.0001-0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.01-0.1g/L、琼脂15.0-20.0g/L，用蒸馏水定容至1L，并调pH为6.0，121℃灭菌20分钟；2)提取牛乳嗜冷菌的基因组挑取待鉴定菌株的单菌落接入70mL的特异筛选培养基中，在温度30-37℃，转速100-200转/分钟的恒温摇床中培养15-25小时后，收集菌株，并提取菌株的DNA；3)PCR扩增将菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：含20mmol/L Mg2+的10×Buffer2μL、2.5mmol/L的dNTPs1.5μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各1μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、DNA模板2μL、双蒸水或三蒸水12μL，扩增条件控制为95℃变性3分钟后进入PCR循环，循环条件为94℃30秒、56℃30秒、72℃70秒，扩增35个循环后72℃延伸补足10分钟，所述的引物F1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′，所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′；4)扩增产物进行电泳检测取3μL步骤3)得到的扩增产物与1μL浓度为0.02-0.05％的溴酚蓝混合，取混合液在含有0.5-1μg/mLEB溶液的0.8-1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，电泳条件为电压60-80V，电流40-50mA，电泳液中含有0.5-1μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前1.5-2cm为止；5)结果判断若扩增后电泳检测出1.5KB大小的扩增产物，即可鉴定该原料乳中的菌株为嗜冷菌假单胞菌。