[发明专利]一种新的纳豆激酶制备方法

摘要

本发明提供了一种新的纳豆激酶的生产方法，其步骤包括：选择和分离出发菌株后将出发菌株接种于斜面培养基，然后制备菌悬液。菌悬液经过LiCl-紫外光照复合诱变，初筛和复筛后选育得到一株产纳豆激酶优良菌株。该菌株经过放大培养后接入液体发酵培养基培养，培养条件接种量1％于2％麦芽糖，4％酵母膏，0.03％CaCl，0.02％K2HPO4，0.02％KH2PO4培养基，然后在34℃，pH7条件下放于200r/min的恒温震荡培养箱中培养48h。最后，通过离子交换型扩张床吸附剂对发酵液中的纳豆激酶进行分离纯化，进一步用分子筛凝胶提纯获得纯品纳豆激酶。该法生产纳豆激酶工艺操作比较简单，原材料易得，菌株产酶效率高，生产过程中无污染，适于工业化生产。

主权项

一种新的纳豆激酶制备方法，其特征包括以下几个步骤：(1)出发菌株的选择和分离首先，从纳豆中挑取表面黏液分离纯化菌株，选择固体培养基上产生拉丝较长的菌落，然后通过液体发酵实验培育后用传统的纤维蛋白平板法比较发酵液的产酶能力，挑选出一株在纤维蛋白平板上产生溶菌圈最大的一株作为出发菌株。(2)菌悬液制备将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基培养24h后，转接入液体种子培养基，于37℃、200r/min振荡培养12h，离心收集菌体，然后用高温灭菌的生理盐水洗涤3‑4次后，转入三角瓶内振荡，制成菌悬液。(3)LiCl‑紫外光照复合诱变纳豆菌对紫外线非常敏感，照射12s致死率就可以达到80％，而根据育种工作者长期的研究和时间经验，认为较低的杀菌率更有利于正突变产生，所以将紫外线辐照时间确定为12s。菌悬液在紫外线下辐照12s后，涂布接种于浓度为0.3％的LiCl的分离平板上。经过初筛和复筛得到一株高产菌株。(4)液体发酵培养复合诱变得到的菌株经过扩大培养后按1％的接种量转接入液体发酵培养基，于34℃，PH 7条件下放于200r/min的恒温震荡培养箱中培养48h。(5)集成化分离纳豆激酶纳豆激酶发酵液中杂质很多，其中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等。采用传统的分离方法需要对发酵液进行预处理，需要经过很多步骤包括离心去除菌体、有机溶剂沉淀、离心收集沉淀、溶解沉淀、离心收集上清液和离子交换层析等，工作量巨大，设备占用多，药品消耗大。本发明采用离子交换型扩张床吸附剂对发酵液中的纳豆激酶进行分离纯化，最后进一步用分子筛凝胶提纯获得纯品纳豆激酶。大大简化了操作步骤，将低了生产成本，同时又大大减少了环境污染。