[发明专利]一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法

摘要

本发明提供了一种检测基因突变位点的方法，包括如下步骤：(1)确定HBV基因逆转录酶区的耐药突变位点；(2)根据这些突变位点设计出扩增引物和每个突变位点的延伸引物；(3)PCR扩增；(4)SAP酶处理；(5)延伸反应；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)质谱检测，确定待检测HBV基因耐药位点。采用本发明提供的方法，解决了现有检测方法灵敏度低、准确率有限，以及通量低，成本高的问题。本发明还提供了检测HBV基因的耐药性突变位点的方法。此外，本发明还提供了用于上述方法的特异性引物及其用于上述检测方法的用途。

主权项

一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：(1)针对待检核苷酸序列的突变位点，确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置和基因型设计一对扩增引物和至少一条延伸引物，其中，扩增引物的长度为30-50bp，其5’端各含10bp的tag；延伸引物的长度为17-28bp，并且其3’末端碱基与突变位点3’端相邻的碱基完全匹配；(3)使用所述扩增引物进行PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；(5)使用所述延伸引物进行延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，且该碱基与突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型；其中所述步骤(2)所使用的扩增引物对为具有下列序列的多核苷酸的组合：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3；并且其中所述步骤(5)所使用的延伸引物包括具有SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：12任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。