[发明专利]一种谷胱甘肽的发酵生产方法

摘要

本发明公开了一种谷胱甘肽的发酵生产方法。所述谷胱甘肽的发酵生产方法是以Pichiapastoris为改造对象的谷胱甘肽的高细胞密度发酵生产方法，共包括四个步骤。所述Pichiapastoris本身具有很好的安全性，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；所述发酵方法简便，发酵原料和培养基成分易得，节省能源，产量大，成本低，适合大、中、小型发酵企业生产；采用本发明一种谷胱甘肽的发酵生产方法，可以达到高细胞密度发酵生产谷胱甘肽的目的。

主权项

一种谷胱甘肽的发酵生产方法，其特征在于：步骤如下：第一步：配制YPD培养基、PTM溶液、基础培养基、流加甘油溶液和流加甘油山梨醇溶液；其中，PTM溶液由FeSO4·7H2O 65g，CuSO4·5H2O 6g，ZnSO4 20g，MnSO4 3g，浓硫酸5mL，HBO30.02g，Na2MoO40.2g，NaI 0.08g，生物素0.2g，加蒸馏水至1L配制而成；基础培养基由85％H3PO4 26.7ml，MgSO4 7.45g，K2SO4 18.2g，KOH 4.13g，CaSO4·2H2O0.93g，甘油40g，PTM溶液4.35ml，加蒸馏水至1L配制而成；流加甘油溶液由甘油700g，PTM溶液12mL，0.2g/L生物素溶液12mL，加蒸馏水至1L配制而成；流加甘油山梨醇溶液由ω-0.7山梨醇水溶液与甘油以1比6.25的体积比混合，然后每升溶液中添加PTM溶液12mL，0.2g/L生物素溶液12mL；第二步：接种：将甘油管Pichia pastoris接种于摇瓶YPD培养基上，在转速250r/min，温度28℃的摇床上培养36h，得到种液；第三步：培养：种子罐装25L基础培养基，高压灭菌，冷却后每升基础培养基加入4.4mLPTM溶液，用浓氨水调pH至5.5，接种4L种液；培养过程开始时，细胞以分批培养的模式生长在基础培养基上，16～24h在培养液中的甘油耗尽后，以控制恒定溶解氧浓度的方式，向培养液中流加甘油溶液，当细胞密度提高至OD600＝200左右，培养结束，得到种子罐种液；第四步：发酵：发酵罐初始装180L基础培养基，高压灭菌，冷却后每升基础培养基加入4.4mL PTM溶液，用浓氨水调pH为5.5，接种40L的种子罐种液，培养过程开始时，细胞以分批培养的模式生长在基础培养基上，16～24h后在培养液中的甘油耗尽后，以控制恒定溶解氧浓度的方式，向培养液中流加700g/L的甘油溶液约100L；流加完毕后，当OD600增至500时，流加甘油和山梨醇溶液以表达，此溶液的消耗量约为58L，此阶段的持续时间40～60h，种子罐和发酵罐在整个过程中均控制温度为28℃，发酵液pH为5.5，以调节搅拌转速和通气量的方式，控制发酵液中的溶解氧为30％。