[发明专利]一种重组猪α干扰素标准品的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，将重组猪α型干扰素的重组菌进行发酵、诱导表达并提取总蛋白，用两步法纯化后得到标准品。本发明制备的重组猪α型干扰素生物学活性参考标准品可用于重组猪α型干扰素特性鉴别和效价测定，以此为标准可使不同批次及同一批次不同次测定的重组猪α型干扰素效价结果更为可信。

主权项

一种重组猪α干扰素标准品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、重组猪α型干扰素工程菌的发酵及蛋白提取：将重组猪α型干扰素工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，保持温度为35-38℃，培养过夜；重组猪α型干扰素工程菌表达质粒为pET-32(a)，装入猪α干扰素基因；基因工程宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；序列是：TGAAAGTGAAAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTGGAATTCATGTGTGACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATCCCCTCATGAGGCTTTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACGCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAGCCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGAAAGCTTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAATCGGCCCAACGCGCGGGGGAGAGGGCGGTTTTGCGTATTTGAGCGCTCTTTCCCGCTTCCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然后将培养得到的阳性克隆菌接种至含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，摇床振荡培养，培养温度为35-38℃，时间为17-20小时；将摇床振荡培养得到的菌液接种至LB培养基中再次进行摇床振荡培养，菌种与LB培养基的体积比为1∶80-100，培养温度为35-38℃，时间为17-20小时；将再次进行摇床振荡后得到菌种接种至含有LB培养基的发酵罐内进行发酵，发酵罐内的溶氧量为25-35％，温度为35-38℃，PH值为7-8；对发酵后的菌种进行检测，当OD600达到0.6-0.8时，在菌种中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，温度为30-35℃，时间为5小时；将诱导后的菌种进行离心、缓冲液重悬、细胞破碎，再次离心取上清液，即重组猪α型干扰素；(2)、重组猪α型干扰素的纯化：亲和层析纯化：将重组猪α型干扰素经过层析柱上样、洗杂，梯度洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰；分子筛层析纯化：将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集洗脱后的蛋白吸收峰，即重组猪α干扰素标准品；