[发明专利]一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法

摘要

本发明公开了一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤：(1)克隆人IL-6基因；(2)构建真核表达载体；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中；(4)通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子；(5)利用14L发酵罐，实现了人IL-6蛋白在发酵罐中高密度生长培养并实现高效分泌表达，培养物上清经PEG沉淀、DEAE阴离子交换和G-75分子筛分离，三步法，得到了纯度达95％以上的重组人IL-6蛋白。本发明改变了传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL-6，探索出用真核宿主毕赤酵母在发酵罐中高密度培养来大量表达IL-6的方法，获得了高纯度的重组人IL-6蛋白，本方法既保证了IL-6的生物学活性，又获得了大量稳定的蛋白。

主权项

一种高密度发酵生产人白细胞介素6的方法，其特征在于：真核宿主为毕赤酵母菌X-33，主要包括以下步骤：(1)克隆人IL-6基因：以人骨髓基质细胞提取总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用IL-6特异引物扩增出完整人重组IL-6基因片段，所用IL-6特异引物中引入Xho I酶切位点和在未端引入NotI酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhIL-6/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαA和质粒rhIL-6/pMD20-T经过Xho I及NotI双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA-IL-6；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA-IL-6用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母X-33宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有400-600μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了高Zeocin抗性的转化子，高抗性转化子以BMGY培养基培养至光密度值＞12.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导120小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhIL-6酵母转化子，摇瓶条件下，该转化子表达的rhIL-6超过30mg/L且分泌的杂蛋白含量较低；(5)高水平分泌表达酵母转化子于YPG培养基培养至光密度值＞20，将上述YPG培养物作为发酵罐的种子菌，按种子菌与基本盐培养基的体积比为1∶10-20的比例将上述种子菌加入到含基本盐培养基的14L发酵罐中，30±1℃，通压缩无菌空气为其提供溶氧，设定发酵罐的溶氧为30％，当基本盐培养基中的甘油耗尽时，补加体积百分比为70％的甘油，当菌体湿重达到350g/L时停止补加甘油，使酵母菌饥饿30分钟后，补加甲醇进行诱导表达，共诱导96h；高水平分泌表达酵母转化子在发酵罐中高密度发酵并大量表达；(6)诱导后的酵母转化子上清液，利用10％PEG-8000沉淀，沉淀蛋白溶于缓冲液中，经透析后，利用DEAE阴离子交换柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0-0.3M NaCl的20mM Tris-Cl缓冲液线性洗脱，收集的样品利用超滤方法浓缩，浓缩样品经Sephadex G-75分子筛分离，收集IL-6目标蛋白，最后得到纯度达95％以上的重组人IL-6蛋白。