[发明专利]体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟装置

摘要

本发明涉及一种体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟装置，该装置是在比利时根特大学人体肠道微生态系统模拟装置(Simulator of Human Intestinal MicrobialEcosystem，SHIME)技术的基础上，针对东方人群的生活习性进行技术改进来达到在体外条件重现人体胃肠道系统。本发明属于微生物学、环境科学、化学、营养学及药物学有机物质分析测定技术领域。

主权项

1、一种在体外条件下重现人体胃肠道及微生态系统的模拟实验方法，其过程和步骤如下：A、模型的建立SHIME模型包括胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠五个玻璃罐，每个玻璃罐由一个带夹层的玻璃罐来存储消化液，每个玻璃罐夹层由塑料管相通并连接到37℃恒温水浴以达到恒温效果；胃和肠消化蠕动通过在每个玻璃罐下用磁力搅拌器进行搅拌加以模拟。在玻璃罐上端用有机玻璃密封，在玻璃中有若干个孔用于向玻璃罐中加入或取出消化液，胃和小肠部分的胃酸及小肠液即从该处通过自动控制自动加入；基于微生物的生长条件，与胃和小肠不同，大肠中三部分pH值通过pH值控制器采用HCL(0.5M)和NaOH(0.5M)溶液自动控制，升结肠、横结肠、降结肠pH值分别在5.6-5.9、6.1-6.4、6.6-6.9，玻璃罐中液体体积分别为500ml、800ml、500ml。通过蠕动转移每个玻璃罐之间消化液；模型采用的食物液成分包括：阿拉伯半乳聚糖、胶质、木聚糖、淀粉、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、粘液素、半胱氨酸；胃酸成分包括：盐酸和胃蛋白酶；小肠液成分包括：胆汁盐、胰酶和碳酸氢钠；B、人体粪便微生物的提取及接种样品采集来自3-5名健康寄主，年龄在20-35岁，并且在过去的一年里未食用抗生素之类的药物；取粪便40g加入到200ml接种液(巯基乙酸钠-磷酸缓冲液0.1M)的接种袋中，用匀浆机拍打3min，静置10min取上层液在离心机中以1000rpm速度下离心10min，分别取50ml上清液接种到SHIME模型升结肠、横结肠和降结肠中；在加入的前24h为微生物稳定期，期间不加任何物质，在随后的2-3个星期为微生物适应期，最后才达到稳定；C、模型的稳定及监护a、模型周期性运转胃模拟玻璃罐每天输入食物液3次，输入时间分别在6:00、12:00、18:00，时间分别为7.5、15、15min，每次输入量为100、100、200ml。胃液输入时间为每天食物液输入之后，时间为22.5、45、45min，输入完全后胃部消化液pH值在1.5左右。1h之后，用蠕动泵将胃消化液转移到小肠模拟器中同时输入小肠液，培养3个小时后全部转移到升结肠中；升结肠、横结肠、降结肠三个玻璃罐容量保持恒定，分别是500、800、500ml；整个模型通过充氮气来保持厌氧环境，每12h充氮气15min；食物添加及所有液体转移均通过恒流蠕动泵在时间控制器的控制下自动完成；b、各项稳定参数的测定(1)、微生物平板计数目前本单位对SHIME模型中肠道微生物检测的种类有7种，分别是：总厌氧菌、总好氧菌、梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌。其中总好氧菌和总厌氧菌采用的培养基是由BD公司提供的脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)，梭菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌采用的培养基是由德国Merck KGaA公司生产的琼脂培养基，分别是：Tryptose Sulfite Cysloserine(TSC)、Mc-Conckey agar(MCC)、Emterococcus agar、Mannistol SaltAgar(MSA)、Rogosa agar；(2)、NH₄⁺的测定作为微生物的代谢产物，NH₄⁺测定使用的是由公司生产的蒸馏仪B-324和Metrohm公司生产的自动电位滴定仪702SM Titriho。具体措施是取1ml模型中消化液到蒸馏管中，然后加入40ml NaOH用蒸汽蒸馏5min，用硼酸吸收后再用硫酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来计算消化液中NH₄⁺的含量；(3)、短链脂肪酸(SCFA)的测定作为微生物的另一种代谢产物，SCFA也是衡量微生物活性的重要指标，需要的仪器包括HACH公司生产的离心管(16×100MM PK/6)和Eppendorf公司生产的高速冷冻离心机5804R；具体步骤为：取分析纯H₂SO₄∶H₂O＝1∶1溶液0.5ml加入到离心管中，在加入消化液2ml，之后加入NaCl 0.4g，再加入内标2-甲基乙酸1ml。向离心管中加入2ml乙醚萃取，最后3000rpm离心5min，上清液转移到样品瓶中冰箱保存待用；(4)、气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)检测色谱仪条件及检测仪条件分别如下：色谱仪条件：FFAP(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.5ml/min，无分流进样，进样量为0.2μl；进样口温度220℃；柱始温70℃(1min)，15℃/min升至160℃，保持6min，30℃/min升至210℃，保持5min，总运行时间18.17min；检测器条件：检测器温度250℃，氢气流量40ml/min，空气流量45ml/min。