[发明专利]一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法

摘要

本发明涉及一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，具体步骤为：(1)MTT法检测细胞存活率，(2)细胞形态观察，(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放含量测定，(4)细胞内ROS水平的测定，(5)细胞内GSH含量测定，(6)细胞内MDA含量的测定，(7)流式细胞仪分析细胞周期和凋亡，(8)透射电镜观察细胞超微结构。本发明的优点：通过监测生物体应激组分的变化，评价多尺度纳米材料对生物体的影响；采用毒理学和细胞生物学学科交叉技术，从细胞水平对多尺度纳米材料的生物学效应及其作用机制进行研究，创建完整的多尺度纳米材料的安全性评价体系。

主权项

1.一种二氧化硅纳米颗粒细胞生物学安全性的评价方法，其特征在于，具体步骤为：(1)MTT法检测细胞存活率细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶能将四氮唑化物MTT由黄色还原为蓝紫色的甲赞，后者溶于有机溶剂DMSO，甲赞的产量与细胞数成正比，在490nm处用酶标仪进行检测吸光度，即可反映细胞存活率和线粒体功能；(1)剂量-效应研究：6种不同尺度的SiO2颗粒，设置2～1000μg/ml浓度组暴露细胞24h，空白对照组加等量体积培养基；实验终止前4h每孔加500μg/ml MTT 10μl；培养结束后，4℃，3000rpm离心5min，小心吸弃上清，每孔加100μlDMSO，震荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用酶标仪，以492nm为实验波长，630nm为参照波长，测定吸收度OD；按公式(1-1)计算细胞的存活率，并以纳米SiO2的不同浓度和细胞的存活率作图，确定纳米SiO2的半数致死剂量；实验重复三次；(2)时间-效应研究：不同尺度纳米SiO2分别处理细胞12，24，36，48h；在各时间终点加入MTT，测定方法如上，由吸光度计算细胞存活率，并作时间-存活率曲线；(2)细胞形态观察24孔板接种细胞，每孔1ml，细胞浓度105/ml；细胞贴壁后，加入不同浓度纳米SiO2，暴露24h后进行苏木素-伊红HE染色处理；染色步骤：(1)4％多聚甲醛固定30min；(2)蒸馏水冲洗5min；(3)苏木素染色10min；(4)冲洗多余的染色液；(5)95％乙醇分化10s；(6)伊红染色液染色2min；然后在光学显微镜下观察，拍照细胞核成蓝黑色，胞浆呈淡红色，凋亡细胞常单个分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂；(3)乳酸脱氢酶LDH释放含量测定LDH是细胞能量代谢中的一个重要的酶，催化乳酸生成丙酮酸，同时产生ATP；如果细胞死亡，胞膜破裂，那么LDH也就从胞浆中释放出来，LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，LDH升得越高就说明细胞损伤得越严重；纳米SiO2处理细胞24h后，去培养基上清，按照LDH试剂盒说明书操作，440nm比色测定OD值，并计算LDH活力；(4)细胞内ROS水平的测定使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，DCFH-DA本身没有荧光，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF；检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平；细胞用不同浓度纳米SiO2暴露24h后，去除细胞培养液，加入适当体积10μmol/LDCFH-DA；37℃细胞培养箱内孵育20min；用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；用多功能酶标仪检测细胞内ROS水平，激发光为488nm，发射光为530nm；(5)细胞内GSH含量测定GSH是一种普遍存在于细胞中的含巯基的小分子，对维持细胞中氧化-抗氧化体系平衡具有重要作用，GSH水平的改变是细胞功能损伤的一个重要标志；纳米SiO2处理24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞(20kHz，2min)，显微镜下观察无细胞后，收集细胞匀浆，12000rpm 4℃离心10min；分别取100μl按GSH测定试剂盒说明书操作，405nm比色测定OD，并计算其活性，细胞匀浆中GSH含量用下列公式1-2计算，结果计为空白对照组的GSH含量的百分比，作图；式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度，MGSH为GSH分子量；(6)细胞内MDA含量的测定纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冰PBS缓冲液洗涤细胞2次，冰PBS缓冲液收集细胞，冰浴中用超声法破碎细胞，显微镜下观察无细胞后，4℃12000rpm离心10min，分别取100μl按MDA测定试剂盒说明书操作，532nm比色测定，并计算其活性，细胞匀浆中MDA含量用下列公式1-3计算，结果计为空白对照组的MDA含量的百分比，作图；式中，ODT为测定管吸光度，OD0为空白管吸光度，ODS为标准管吸光度，CS为标准管浓度；(7)流式细胞仪分析细胞周期和凋亡细胞用不同浓度纳米SiO2处理24h后，消化、离心收集细胞，离心条件为1500rpm，5min，用PBS缓冲液洗细胞两次，离心收集，离心条件为1500rpm，5min，加入预冷的70％乙醇1ml，4℃固定细胞过夜；离心条件为1500rpm，5min，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞一次，离心收集，离心条件为1500rpm，5min；用终浓度为50μg/ml PI染色，室温30min；使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并作图，分析细胞亚G1峰含量变化；(8)透射电镜观察细胞超微结构纳米SiO2暴露细胞24h后，离心收集细胞，冷PBS洗2次，3％戊二醛固定30min以上，锇酸固定，经梯度脱水后包埋；超薄切片，透射电镜下观察其超微结构并拍片。