[发明专利]利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法

摘要

本发明涉及一种利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，从促生拮抗菌M18基因组中扩增出吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因片段phzA1-G1，并将该基因片段插入表达质粒pME6032中，置于强启动子Ptac的控制下，构建成重组质粒pME6032Phz；然后将该重组质粒导入促生拮抗菌M18的衍生菌株M18G中，构建成基因工程菌株M18G/pME6032Phz。该工程菌株在扩增吩嗪-1-羧酸生物合成编码基因的拷贝数的同时，实现编码基因的高效稳定表达。最后将基因工程菌株M18G/pME6032Phz在黄豆粉培养液中培养，高效稳定地生产吩嗪-1-羧酸，大幅提高吩嗪-1-羧酸的产量。利用本发明的高产基因工程菌株制备吩嗪-1-羧酸，其生产成本能达到应用于防治水稻纹枯病的农本要求，可用于杀菌剂申嗪霉素的制备，大规模地防治植物病害。

主权项

一种利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于包括如下步骤：1)设计一对引物，引物的核苷酸序列如下：正向：5’-ATATATGGTACCGCCAGCGAATAACCGATGCCGCGAGGGAA-3’反向：5’-TGCGTAAGATCTCGATGGGTTCGCTCATGGGTGCTTCCTTTT-3’序列中下划线为限制性内切酶Kpn I、Bal II的酶切位点；然后以促生拮抗菌M18基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶LA Taq和设计的引物，扩增吩嗪-1-羧酸生物合成的编码基因，扩增产物通过琼脂糖电泳检测，回收长度为6.8kb的基因片段phzA1-G1；2)将回收的基因扩增片段phzA1-G1，经限制性内切酶Kpn I、Bgl II酶切，连接酶连接，插入大肠杆菌/假单胞菌穿梭表达质粒pME6032，并将吩嗪-1-羧酸生物合成编码基因的表达置于强启动子Ptac控制下，形成重组质粒pME6032Phz并转化进入大肠杆菌；从大肠杆菌中提取构建的基因重组质粒pME6032Phz；3)制备促生拮抗菌M18衍生菌株M18G的感受态细胞，并将上述基因重组质粒pME6032Phz转化到M18G的感受态细胞中，在28～37℃条件下，培养1～2天，从中筛选出基因工程菌株M18G/pME6032Phz；4)将基因工程菌株M18G/pME6032Phz接种在甘油培养基的平板上，在26～30℃下，活化生长20～24小时，再次在甘油培养基的平板上划菌块，26～30℃下活化10～12小时，然后将活化的M18G/pME6032Phz菌块转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26～30℃的摇床中振荡培养9～11小时，摇床转速为160～180转/分；最后转接到含有65毫升黄豆粉培养液、体积为250毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为60～72小时，得到吩嗪-1-羧酸含量为每升5700～6600毫克；其中，所述甘油培养基和甘油培养液中含有的组分重量百分比为：蛋白胨1.8～2.2％、甘油1.3～1.7％、硫酸镁0.05～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、余量为水，pH 6.8～7.2；所述黄豆粉培养液的组分重量百分比为：黄豆粉4.5～5.5％、玉米浆1.4～1.7％、葡萄糖1.0～1.4％、余量为水，pH 6.5～7.0。