[发明专利]一种检测伏马菌毒素B1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

摘要

一种检测伏马菌毒素B1(FB1)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对粮食，饲料以及食品中FB1含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测FB1。微孔板包被有FB1-BSA，加FB1标准或样品，再加FB1单克隆抗体。游离的FB1与微孔板上的FB1-BSA竞争FB1单克隆抗体，没有连接的FB1单克隆抗体洗涤除去，加Eu3+-羊抗鼠抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的FB1浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中FB1的含量。本发明提供的试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.05ng/mL以上。

主权项

一种检测伏马菌毒素B1，简称FB1，的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征是：试剂盒由以下几个部分：包被有FB1-BSA的96或48孔包被板(1)，缓冲液(2)，伏马菌毒素B1标准(3)，伏马菌毒素B1单克隆抗体冻干品(4)，铕标记的羊抗鼠抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成；FB1-BSA活性包被板(1)的制备：包被板(1)包被固相抗原：用pH 9.6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存；缓冲液(2)：含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；6×FB1标准液(3)：1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL；铕标记的羊抗鼠抗体(5)的制备：取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS的5g/L羊抗鼠抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH 8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L，取500-1000μL稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16h，反应液经用pH 7.8、80mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的1×40cm的Sephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用；洗涤液(6)：含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；增强液(7)：每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。