[发明专利]一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法

摘要

一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，它涉及一种表达牛胰蛋白酶的方法。解决了现有牛胰蛋白酶目前还不能在乳酸乳球菌中表达的问题。方法：将野生型牛胰蛋白酶N端的8个密码子和所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并引入识别序列，然后与pUC57连接转化DH5α，筛选阳性转化子pUC57-trym，再与表达载体pSEC-E7同时双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym，电转化转入乳酸乳球菌NZ9000，厌氧培养后经乳链菌肽Nisin诱导，即完成。本发明使人工合成牛胰蛋白酶成功地在乳酸乳球菌中进行表达，且具有生物学活性。

主权项

一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法按以下步骤实现：一、将编码野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8个氨基酸的密码子和牛胰蛋白酶中所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并在其5′、3′端分别引入带有Nsi I和Spe I的识别序列，然后与克隆载体pUC57一起连接转化大肠杆菌DH5α，再筛选阳性转化子pUC57-trym；二、将pUC57-trym和表达载体pSEC-E7分别经Nsi I和Spe I双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym；三、将pSEC-trym经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，得含有重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鉴定；四、将NZ9000-pSEC-trym接种于GM17液体培养基中，在30℃下厌氧培养过夜后，取培养物，然后以1∶25的体积比接种于GM17液体培养基中进行扩增培养，在30℃下厌氧培养至OD600为0.4～0.6，再用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，即完成在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶。